腺相關病毒（AAVs）已被批準用于基因治療——將遺傳物質輸送到靶組織。制備AAV介導的基因療法的一個挑戰是質量控制，尤其是空殼與負載（全衣殼）的比例。在這里，我們展示了如何在AAV血清型中使用質量光度計，以可靠且可重復地測量AAV樣品純度和空殼/負載比率。這些測量可以在幾分鐘內用少量樣品進行。

目前正在尋求以AAVs為運載工具的基因療法，以治療帕金森氏癥、遺傳性失明、脊髓肌萎縮和血友病等疾病，取得了有希望的結果和良好的安全性。盡管在純化過程中取得了進展，但由于缺乏快速可靠的方法來評估AAV的完整性、成功包裝的遺傳物質的數量以及宿主細胞和輔助病毒中蛋白質和核酸污染物的存在，AAV的生產受到阻礙。有缺陷或空的AAV是不受歡迎的，因為它們可以在治療過程中競爭細胞受體，降低治療效果，并導致意外的免疫反應。。

質量光度計適用于AAV分析

質量光度計測量單個粒子的質量，該測量既不受粒子大小也不受其形狀的影響。由于AAV衣殼在負載時質量增加，但其大小和形狀不變，因此質量光度計是量化AAV裝載的理想方法（圖1）。空載的和負載的AAV之間的差異可以使用質量光度計清楚地解決（圖5）。質量光度計還可以檢測AAV樣品中的污染物，其質量往往較低（圖1）。

在用于量化AAV空殼/負載比率的替代方法中，最常見的是分析超速離心和透射電鏡。然而，這些方法在技術上具有挑戰性，涉及大量的樣品工作，并且在成本以及分析所需的時間和樣品量方面都很昂貴2。相比之下，質量光度計快速（測量一個樣品大約需要一分鐘），只需要很少的樣品。在本應用說明中，我們演示了如何使用質量光度計來量化AAV負載和檢測雜質。

質量光度計測定準確無誤

首先，我們選擇了一個模型，用質量光度計測量了空AAV5衣殼樣品的質量分布。我們通過對同一樣本進行六次獨立測量來評估準確度，得出了高度一致的結果（Rg.2）。在每次質量光度計測量中，主峰對應于空殼，而較低質量的信號則表明存在污染物。AAV5衣殼分子質量的平均值和標準偏差為3.69+/-0.10 MDa。由于這些衣殼的預期分子質量為3.7 MDa，因此該結果具有極好的質量精度（2.7%）和高精度。

AAV血清型的質量光度計測定工作

AAV存在于許多亞單位組成和序列不同的血清型中。這些血清型特異性影響其免疫原性、向性和受體結合。因此，針對不同組織時，AAV血清型的選擇很重要。除了自然出現的血清型外，還開發了合成血清型。一種人工合成的AAV-DJ結合了八種不同野生型病毒的序列，導致免疫原性降低；在體內，它以肝臟為靶點。

為了測試質量光度計是否適用于AAV血清型，我們測量了包含四種不同血清型（AAV5、AAV6、AAV8和AAVDJ）的空衣殼的樣本。在每種情況下，都觀察到一個單一的對稱峰，大約3.7 MDa。獲得的結果清楚地表明，質量光度計在血清型中產生一致的結果（圖3）。

量化AAV空殼/負載比率

在描述AAV特征時，最重要的參數之一是空殼/負載比率，它反映了包含感興趣基因組拷貝的衣殼的比例。為了探索如何使用質量光度計測量該參數，我們制備了含有不同數量的商用空和滿AAV8衣殼制劑的混合物。然后，我們使用質量光度計測量每個混合物中滿載衣殼的百分比（圖4）。測得的百分比與預期值非常匹配（根據每種混合物中全衣殼制劑和空衣殼制劑的比例以及制造商關于每種制劑的信息計算得出）。混合物的預測負荷為空：0%；混合物1:32%；混合物2:48%；混合物3:63%；混合物4:95%。

含有空殼/負載AAV的混合物的質量分布有兩個峰值（圖4）。3.7 MDa左右的峰值對應于空衣殼，而較高質量的峰值對應于全衣殼。通過對峰值之間的對比度差進行DNA校準，可以確定全衣殼中DNA負載的質量（見下文）。

這些結果表明，質量光度計始終能夠獲得AAV制劑的負載百分比（或空殼/負載比率）的可重復和可靠測量值。

確定AAV裝載物的質量

除了測量空殼/負載比率和識別污染物外，質量光度計還可用于量化AAV衣殼基因組裝載物的質量。為了測量裝載物的質量，我們假設兩個峰值（空殼和負載）之間的質量光度計測定信號的差異是由于該裝載物的存在。為了將這種差異轉化為裝載物的質量，我們在質量光度計計上對DNA進行了特定校準，因為DNA的折射率不同于蛋白質的折射率。總的來說，對重組蛋白的三組測量表明，使用質量光度計在單個分子水平上監測樣本中的所有蛋白質物種，可以對難以分析的多步驟反應提供有價值的見解。

在AAV5衣殼的測量中，我們發現兩個峰值之間AAV衣殼質量的平均差異對應于1.5+/-0.1 MDa的核酸量（圖5），這非常接近4.8 kb基因組預測的1.6 MDa。

總結

質量光度計為評估AAV樣品的質量提供了重要信息。通過使用質量光度計測量AAV樣品中顆粒的質量分布，可以量化空/滿AAV衣殼比，檢測污染物并測量AAV裝載物的質量。這些測量只需幾分鐘，使用很少的樣品（這里使用20μL稀釋至每毫升1x1011個顆粒的樣品），并且只需要基本的實驗室技能。總的來說，質量光度計可以作為一種快速可靠的AAV質量控制方法。

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