血液4D-DIA蛋白組項目文章NC（IF 17.69）|西南醫院柴進教授團隊


 

原發性膽管炎(PBC)是一種慢性自身免疫性肝病,全世界每年有超過10萬例PBC新確診病例。病理上顯示PBC最初破壞肝內小膽管中的膽道上皮細胞(BECs)，臨床上表現為出現抗線粒體抗體(AMA)。之前的研究表明進行性體液和細胞免疫反應可破壞BECs，但是自身免疫反應破壞PBC患者肝臟中的小BECs的機制，及在PBC發病的早期階段BECs的靶點目前尚不清楚。此外，之前的研究發現聚合免疫球蛋白受體（pIgR）可引起BEC的凋亡和膽道損傷，但是pIgR是否或如何參與PBC的發展和進展，尤其是在PBC發病的早期階段也不清楚。
 

2023年2月9日，第三軍醫大學第一附屬醫院(西南醫院)消化內科兼膽汁淤積性肝病中心柴進教授團隊在Nature Communications（IF 17.694）發表了題目為“Unique DUOX2⁺ACE2⁺small cholangiocytes are pathogenic targets for primary biliary cholangitis”的研究成果，該研究利用單細胞RNA測序、流式分選(FACS)等方法，在人和小鼠肝臟中鑒定了一種獨特類型的DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細胞。作者還通過血液蛋白質組學、qRCR等方法發現pIgR在DUOX2⁺ACE2⁺膽管細胞中高度表達。研究證實高表達pIgR抗原的DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細胞是PBC的致病靶點。中科新生命為該研究提供血液4D-DIA蛋白質組學技術服務。

 研究材料

對照組和PBC患者肝臟樣本和血清樣本、小鼠肝臟樣本

技術路線

步驟1：PBC肝臟單細胞轉錄組圖譜；

步驟2：獨特DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細胞的發現；

步驟3： DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細胞在PBC中的功能及臨床意義研究；

步驟4：尋找與DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細胞損傷有關的免疫細胞；

步驟5：尋找與DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細胞損傷有關的免疫細胞中關鍵蛋白。

 研究內容

1. PBC肝臟單細胞轉錄組圖譜

作者對4名對照組受試者（CTR）和5名PBC患者的肝臟進行了單細胞轉錄組測序分析（圖1a），質控后共獲得70,050個肝細胞。UMAP（統一流形逼近與投影）分析顯示共鑒定到30個細胞群(圖1b)，分為11種細胞類型(圖1d)。細胞類型差異分析發現與對照組相比，PBC肝臟中內皮細胞、膽管細胞和間充質細胞的比例減少，而T細胞和漿細胞的比例增加（圖1g-1h）。

圖1 肝細胞的單細胞轉錄組圖譜

2. 在人類和小鼠肝臟中發現獨特的DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細胞

由于PBC的特點是選擇性破壞小BECs，作者進一步分析了膽管細胞。結果發現膽管細胞共分為8個簇(圖2a-2b)，其中膽管細胞簇（3）僅在對照組中被檢測到，而未在PBC肝臟中檢測到（圖2c-2d）。此外，膽管細胞簇（3）的雙氧化酶2 (DUOX2)和血管緊張素轉換酶2 (ACE2)呈現高表達的狀態（在其他膽管細胞簇中表達非常低）（圖2e-2f），這表明人類肝臟中有一個獨特的膽管細胞亞群是PBC的潛在靶點。接下來，作者通過流式細胞分選、RNAscope、qPCR等方法證實肝細胞高表達CK19、DUOX2和ACE2，且高表達膽管細胞特異性標記物、高表達小膽管細胞的標記基因（圖2g-2j），故作者將膽管細胞簇（3）定義為DUOX2⁺ACE2⁺膽管細胞。

圖2 DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細胞的鑒定

3. DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細胞在PBC中的功能及臨床意義研究

KEGG通路分析發現與其他膽管細胞簇相比，DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細胞中膽汁分泌通路顯著富集(圖3a)。且肝臟切片RNAscope和多重IF分析顯示，與對照組相比，PBC患者小膽管中DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細胞的數量顯著減少(圖3b-e)。此外，DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細胞數量的減少與PBC的嚴重程度顯著相關（圖3f）。另外，在AMA-M2陽性或AMA-M2陰性的PBC患者中，肝臟DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細胞數量顯著減少，但在阻塞性膽汁淤積癥(OC)、繼發性硬化性膽管炎(SSC)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者中則沒有(圖3g)。綜上所述，PBC中肝臟DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細胞數量顯著減少與膽汁分泌障礙和PBC嚴重程度密切相關。

圖3 DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細胞數量的減少與膽汁分泌障礙和PBC嚴重程度顯著相關

4. CD27+記憶B細胞和漿細胞聚集在PBC患者的肝門靜脈區，并與DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細胞相互作用

眾所周知，PBC是由自身免疫介導的膽道損傷引起的。為了研究哪些免疫細胞浸潤與DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細胞損傷有關，作者使用蘇木精-伊紅(HE)(圖4a)、空間轉錄組學(ST)(圖4b-e)和多重IF分析(圖4f)對照組和PBC患者的冷凍肝臟切片進行分析。 結果發現與對照組相比，PBC肝切片中B細胞、漿細胞和T細胞比例增加（圖4c），PBC肝門靜脈區位置B細胞和漿細胞浸潤明顯增加、單核細胞和NK細胞比例明顯降低(圖4d-4e)、DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細胞數量顯著減少而B細胞和漿細胞數量顯著增加（圖4f）、CD27+記憶B細胞數量顯著增加（圖4f）。此外，與對照組相比，PBC患者的漿細胞克隆擴增增加(圖4g)。接下來，作者使用CellPhoneDB分析了DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細胞與免疫細胞之間的潛在相互作用。結果顯示配體與DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細胞和免疫細胞表達的受體之間存在顯著的相互作用(圖5a-c)。綜上所述，PBC發病過程中，免疫應答與肝臟DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細胞數量的選擇性減少有關，也可能通過細胞-細胞相互作用影響其他類型的膽管細胞。

圖4 CD27+記憶B和漿細胞在PBC患者肝門靜脈區聚集

圖5 DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細胞與免疫細胞的相互作用

5. PBC患者肝臟pIgR在DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細胞中高表達，血清抗pIgR抗體水平明顯升高

為了研究漿細胞產生的自身抗體與肝臟DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細胞損傷的關系，作者對對照組和PBC患者的血清樣本進行4D-DIA蛋白質組學分析（未去除血清高豐度蛋白） (圖6a-6b)。血清蛋白質組學共定量到2805個蛋白，其中50個蛋白顯著上調、87個蛋白顯著下調（PBS/TCR）(圖6c)。顯著差異分析和火山圖結果顯示PBC患者血清pIgR水平明顯高于對照組（圖6d-6e）, PBC患者血清抗pIgR抗體水平也顯著升高(圖6f)。對人類和/或小鼠肝細胞的進一步分析顯示，在DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細胞中，pIgR mRNA轉錄物和蛋白質的水平明顯高于DUOX2^-ACE2^-膽管細胞和其他類型的肝細胞(圖6h-j)。另外，在對照組肝臟中，pIgR蛋白主要在DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細胞中檢測到，而在PBC肝臟中，pIgR蛋白的表達明顯降低 (圖6k)。綜上所述，在人類PBC的致病過程中，pIgR特異性自身抗體可能與DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細胞損傷有關。

圖6 pIgR主要在DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細胞中表達，PBC患者血清中pIgR及其抗體水平明顯升高

 小結

該研究通過結合單細胞轉錄測序、多重免疫熒光(IF)等的方法鑒定出肝臟中獨特的DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細胞，并驗證了其減少與PBC疾病嚴重程度的相關性。此外通過血清蛋白質組學（4D-DIA）等方法證實了pIgR在DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細胞中的高表達。該結果為PBC的早期致病過程提供了新的見解，并為PBC的診斷和治療干預提供了特定的生物標志物。

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