論單通道檢測在發酵尾氣分析中的應用
論文已發表在《發酵科技通訊》2022年4期
由圖 1 可知：在臨界點改變攪拌轉速后，細胞快 速進入對數生長期 。 實驗中根據臨界點及曲線變化 趨 勢，恰 當 掌握攪拌轉速 調 整時機，滿 足 供 氧 需 求，使植酸酶表達量及酶活均達較高水平 。
2．2．2 利用臨界點進行補料
流加補料－分 批 發 酵[19－23] 是現代發酵工 程 普 遍 采用的方式，可以較好地解決底物阻遏，按設備能力 供氧，減緩代謝有害物的不利影響；尤其對于基因工 程菌高密度發酵，流加補料是實現高密度發酵必不 可少的手段 。流加補料技術的關鍵是對補料時機的 把握，利用發酵尾 氣分析曲線中的臨界點能夠比較 精準地掌控補料時機 。
某大型藥企在重 組 大 腸 桿 菌培養白細 胞 介 素－ Ⅱ 生產過程中，在 1t 生產罐上應用 FGA 發酵尾 氣 分析儀，監測尾 氣 變 化，其 發 酵 過 程 CER 曲 線 如 圖 2 所 示 。 由 圖 2 可 以 看 出 CO2 的 整 體 變 化 規 律： 1) 發酵開 始 后，CER 先 有 極 短 的 平 緩 區，很 快 在 1h32min時曲線 出 現 快 速 上 升 的 臨 界 點，預 示 重 組大腸桿菌生長進入對數生長期，此時開始流加補 料，并根據 DO反饋值調整攪拌轉速，保 持 DO 在 較 高水平 。2) 在 CER迅速上升的對數生長期，逐漸提 高流加補料速率，在達到峰值，出現臨界點時，流加速 率達到最大 。3) 在 發 酵 后 期，補 料 速 率 維 持 在 某 一 穩定水平，直至發酵結 束 。整 個 發 酵 過 程 約 10h，產 物表達量 占 菌 體 總 蛋 白 的 40％ 。 發 酵 過 程 中 對 數 生長期起點和終點(臨界 點) 的 出 現 都 發 生 在 1 min 內，如非采用實時連續在線檢測是難以觀察到的 。
2．3 利用臨界點進行誘導
在重組大 腸 桿 菌 發 酵 過 程 中，通 常 采 用 IPTG 誘導劑進 行 誘 導 。 IPTG 誘 導 劑 具 有 一 定 毒 性，對宿主和代謝產物有抑制作用，且 費 用 高 昂，在 工 業 化 大規模生產中較難推廣 。乳糖是一種廉價資源，可以 作為碳源被大腸桿菌代謝利用，有報道在重組蛋白培養中用其作誘導劑，但尚不普遍，究其原因，除誘導機 理復雜外，乳糖誘導時機不易把握也是重要因素 。
張毅 等[24] 在 LB 培 養 基 中，分 別 在 對 數 生 長 期 的早 期 、中 期 以 及 后 期 對 融 合 蛋 白 表 達 菌 BL21 (DE3)(pFu) 進行 乳 糖 誘 導，發 現：乳糖的加入會造 成菌體生長遲滯，在 早 期 、中 期 進 行誘導均不理想， 只有在后期進行誘 導 效 果 最 佳，此 時既可以得到較 高的表達產物，又可以獲得較高 的 菌 體 密度 。 有 研 究報道[22－30] 表明：在培養基葡萄糖剛剛耗盡，細胞濃 度增加緩慢或略有下降時開始誘導，效果最佳 。
應 用 發 酵 尾 氣 分 析 技 術，可 以 直 觀 地 辨 識 菌 體 生長的各個階 段 。 一般在對 數生長期的后期，即 培 養基中葡萄糖剛剛 耗 盡，細胞濃度增加緩慢或略有 下降時，尾氣分析的 CER 曲線會出現一個由上升轉 為下降的臨界點，利用該臨界點可 以方便地確定誘 導時機，及時進行乳糖誘導 。
2．2．4 利用臨界點處理異常發酵
雖然微生物發酵是一個非線性時變系統，包含了 生物、化學及物理的各種變化，過程較為復雜，但是當 各 種 條 件 固 定 后，微 生 物 細 胞 代 謝 又 遵 循 一 定 的 規 律 。從發酵尾氣分析得到的大量數據來看，在某種發 酵體系中，當工藝條件確定后，其 分析曲線整體形態 是確定的，一旦發生改變，通常 預 示著某種代謝的改 變 。 因此，捕捉那些異 常 臨 界 點，對異常發酵的及早 發現和處理很有意義，特別是對工業大生產和高附加 值的生物制藥更是如此 。就此而言，尾氣分析的敏感 性和實用性均超過了 pH 、DO等其他現有檢測手段 。
在廣東某高校進行的重組大腸桿菌發酵 藥 物 蛋 白實驗中，發酵開始后，經過短暫的遲緩期，CO2 曲線 開始緩慢上 升，約 2h 后 發 酵 快 速 進 入 對 數 生 長 期； 20min后，CO2 曲 線 突 然 出 現 了 下 折，CO2 體積分數 迅速下降，在不到 30min 的時間內下降到接種前水平， 鏡檢觀察，發現此時發酵液中的工程菌已經消失，判斷 感染了噬菌體，隨即停止發酵，并迅速進行滅菌處理。 該實驗過程的 CO2 體積分數變化曲線如圖 3 所示。
3 實時連續在線檢測
3．1 實時連續在線檢測的意義
利 用 發 酵 尾 氣 分 析 技 術，特 別 是 利 用 分 析 曲 線 上的臨界點，監測發酵過程中細胞的代謝變化，可以 為發酵操作及進一步工藝優化提供 依 據 。 發酵尾氣 分析技術的關鍵在于對發酵過程中尾氣的 CO2 及 O2 進行實時連續在線監測，只有這樣才能捕捉到發酵狀 態改變的臨界點，監測到細胞代謝狀態的改變 。 由于 發酵過程中臨界點的出現和狀態的改變往往 發 生 在 極短的時間內，所以實時連續在線檢測尤為重要 。
3．2 采用單通道確保實時連續在線檢測
隨 著 現 代 科 技 的 發 展，發 酵 尾 氣 分 析 所 采 用 的 各檢測部件本身的響應時間非常短，一般在毫秒級， 但從發酵罐排氣口到檢測腔，尾氣的傳輸需要時間， 相比之下檢測時間 可 忽 略 不 計，故完成一次檢測的 時間主要取決于尾氣的傳輸時間 。
雖然采用一套檢測部件加轉換開關對多 套 發 酵 設備分時切換輪巡檢測的方式，可以實現一套尾氣分 析系統測定多點尾氣，降低發 酵 設 備 的 平 均 成 本，但 是在切換過程中，氣路轉換無 法 瞬 間 完 成，必 須 反 復 用后一通道的尾氣頂出前一通道的尾氣，會造成尾氣 混合帶來檢測誤差，此外還存 在 傳 輸 時 間 長 、信 號 延 時等問題，也增加了 染 菌 風 險 。 因 此，在 進 行 發 酵 尾 氣分析檢測時，應 該 采 用 獨 立 的 單 通 道 檢 測，即一套 檢測設備連接一個發酵罐，唯有采用此方式才可以實 現實時連續在線檢測，捕捉到那些極其重要的臨界點。
4 結 論
應用發酵尾氣分析技術可以深入了解細胞的代 謝狀況 。分析曲線上的“臨界點”往往反映了發酵過 程狀態的改變，對研究發 酵工藝至關重要 。 要 捕 捉 這些臨界點就需要進行實時連續在線檢測，唯 有 采 用獨立的單通 道檢測方能做到 。 目 前，發 酵 尾 氣 分 析技術日臻成熟，尾氣分析裝置也成為發酵罐的標 準配置 。 隨著設備的普及和尾氣分析在多方面應用 的深入開展，業界對其應用效果的期望愈來愈高，單 通道檢測 在發酵尾氣分析中 的 意 義 會 日 益 清 晰 明 了，該檢測方式有望被業界廣泛接受 。
參考文獻：（略）
論單通道檢測在發酵尾氣分析中的應用
公維麗1，2，劉仲匯1，2，馬耀宏1，2，史建國1，2
(1．齊魯工業大學(山東省科學院) 生物研究所，山東 濟南 250014；2．山東省生物傳感器重點實驗室，山東 濟南 250014)
摘要：發酵尾氣分析技術在業內的應用已逐漸展開，但人們對單通道檢測的認識依舊模糊 。從尾氣分析的意義、生物過程的“實時性”以及發酵過程的“臨界點”反映發酵狀態的改變等方面，闡述了發 酵尾氣分析應采用實時、連續、在線檢測；通過以尾氣分析獲得的“臨界點”在發酵工程中的應用(指 導轉速調整、流加補料、乳糖誘導及處理異常發酵)，進一步闡明只有單通道檢測才能真正做到檢測 的實時、連續、在線，捕捉到有價值的“臨界點”信息。
關鍵詞：發酵；尾氣分析；單通道；檢測
中圖分類號：Q819 文獻標志碼：A 文章編號：1674－2214(2022)04－0217－05 DOI:10. 16774/j.cnki.issn. 1674-2214.2022.04.009
Discussion on the application ofsingle channel detection in fermentation tail gas
analysis
GONG Weili1，2， LIU Zhonghui1，2， MA Yaohong1，2， SHI Jianguo1，2
(1．Qilu University of Technology (Shandong Academy of Sciences)， Biology Institute，Jinan 250014， China；
2．Shandong Provincial Key Laboratory of Biosensors，Jinan 250014， China)
Abstract： The technology of fermentation tail gas analysis has been gradually developed and applied in the industry，but single－channel detection is still poorly understood．In this paper，we expounded that fermentation tail gas analysis should adopt real－time continuous online detection from the significance of fermentation tail gas analysis，the “real－time”of biological process，and the critical point of fermentation tail gas analysis curve reflecting the change information of process state，and the critical point obtained from tail gas analysis in fermentation engineering (guidance of speed adjustment，flow feeding， lactose induction and treatment of abnormal fermentation) illustrated that only single channel detection can achieve real－time，continuous and online detection，and capture valuable “critical point”information．
Keywords： fermentation； tail gas analysis； single channel； detection
收稿日期：2022－09－01
基金項目：齊魯工業大學科教產融合試點工程基礎研究類基金資助項目 (2022PY067)；齊魯工業大學科教產重大創新專項(2022JBZ01－06)； 山東省重點研發計劃項目 (重大關鍵技術)(2016ZDJS07A20)
作者簡介：公維麗(1988 — )，女，山東臨沂人，副研究員，研究方向為生物傳感器技術 、微生物發酵工程，E－mail：15264110812＠163．com。
通信作者：劉仲匯高級工程師，E－mail：sws2605384＠163．com。
發酵尾氣分析指在發酵過程中在線檢測尾氣中 的 CO2 和 O2 的體 積 分 數，計 算 呼 吸 代 謝 參 數 CO2 釋放率(Carbon dioxide evolution rate，CER)、攝 氧 率(Oxygen uptake rate，OUR) 和 呼 吸 商 (Respira－ tory quotient，RQ)，得到細胞代謝信息，是發酵工程 的一種過程分析技術(Process analysis technology， PAT)。 無論 是 在 微 生 物 生 長 階 段，還 是 在 產 物 合成階段，CER 的變化都與菌 體 生 長 狀 態 、碳 源 的 消耗和供氧情 況 密 切 相 關 。 OUR 雖然取決于菌體濃度，但是也與發酵 液 的 營 養 成 分 、溶 氧 水 平 、菌 體 的比生長 速 率 以 及 碳 源 的 種 類 和 濃 度 等 因 素 有 關 。RQ的變化反 映 了 微 生 物 胞 內 代 謝 的 變 化，揭 示 了發酵過程中微觀代謝途徑通量的變化，是 微 生 物 菌體生長 、能量代謝維持 、產物和副產物合成代謝共同作用的結果[1－7] 。利用這些參數及相關性分 析，可 以 更好地對發酵過程進行監測 、分析，從而深入了解發 酵規律，優化發酵 工 藝，控 制 發 酵 過 程，提 高 發 酵 產 率和產量，降低成本，加快新品研發和產業化 。
與溶解氧和 pH 檢 測 相 比，尾 氣 分 析 得 到 的 參 數 CER，OUR 和 RQ 在 一定 程度上反映了發酵過 程的部分特質，揭示了微生物的生理特性，具有生物 學意義 。尾氣分析時僅采集 發酵罐排出的尾氣，不 影響發酵罐 結 構，不 接 觸 發 酵 液，無 染 菌 風 險[8－10]， 更容易被業界接受，故成為現代發酵工程的重要分析 手段，已被應用于發酵、制藥、生化、農業、環保和食品 等領域 。 雖然該技術已在業內得到應用，但是由于歷 史原因以及設備成本等因素的影響，對檢測設備是否 需要采用獨立的單 通 道，認 識 依 舊 模 糊 。 因 此，筆 者 從理論與實際應用兩方面對該問題加以分析探討 。
1 發酵尾氣分析應實時連續在線
在 發 酵 過 程 中，微 生 物 生 長 一 般 需 要 經 歷 遲 緩 期 、對數生 長 期 、穩 定 期 和 衰 亡 期[11] 。 常 規 的 液 態 好氧分批發酵周期一般為數小時至數天 。在看似較 長的發酵過程中，發酵狀態的轉變 往往發生在很短 的時間內，某些代謝變化可能用時更短 。
張嗣良等 在《多 尺 度 微 生 物 過 程 優 化》[12] 及 相 關論 文[13] 中 詳細闡述了生 物 過 程 的 “實 時 性 ”： 1) 從生物 過程發生的時 間以及 生物技術發展特點 來看，對于以活細 胞為主體的細胞 大規模培養的生 物反應過程，可粗分為在以基因水平的分子尺度 、代 謝調節的細胞尺度和工藝控制的反應器尺度上發生 的；2) 可將微 生 物 和 細 胞 在 酶 活 性 水 平 上(包 括 酶 的激活 、抑制，亞基的結合和解離以及共價修飾和降 解) 控制的時間常數描述在毫秒至秒的范圍內，在基 因表達調控水平上(誘 導 、轉 錄的阻遏和去阻遏) 描 述至分鐘 。考察微 生 物 和 細 胞 代 謝 調 節，在 以 秒 為 單位的時間尺 度 上 是 合 適 的 。 因 此，作 為 動 態 觀 測 記錄細胞代謝狀況 的 發 酵 尾 氣 分 析 設 備，應 對 排 出 的尾氣進行實時連續在線檢測，只有這樣，才能準確 捕捉到發酵過程中代謝的改變 。
2 合理利用發酵過程中的臨界點
2．1 發酵過程中的臨界點
李強等[14] 在《微生物發酵 中 二 氧 化 碳 釋 放 速 率 變化規律》中，通過青霉素 、古龍酸 、二元酸和葡萄糖 酸 4 個體系的發酵實驗及動力學分析，對 CER 的變化規律進行了探 究，研 究 結 果 表 明：無 論 是 霉 菌 、酵 母菌 、細 菌 、單 液 相 體 系 、雙 液 相 體 系，還 是 純 種 發 酵 、混合菌發 酵，CER 的 變 化 都 與 體 系 狀 態 變 化 有 著密切聯系；CER 曲線上的轉 折 點 對 應 的 就 是 發 酵 狀態的轉變點 。 由該文獻的 CER 曲線可以發現：在 這些轉折點處曲線發生了方向性改變，即 由 升 轉 為 降，或者由降轉為 升，曲線出現明顯的峰或谷，發 酵 體系的狀態都發生了顯著改變 。
在發酵過程中還存在另一類極具價值 的 變 化 點，即發酵體系的狀態變化由緩慢到快速，或由快速 轉為緩慢的時間點，比如在微生物生長由遲緩期進 入對數生長期，由 對數生長期進入穩定期以及由穩 定期進入衰亡期的那些時間點上，都有可能出現該 情況 。在這類時間點上，雖然發酵體系的 CER 曲線 沒有發生方向性改 變(由 升到降或由降到升)，但 是 發生了變化速率的 顯 著 改 變，或者說發生了從一個 發酵階段轉變到另一個發酵階段 。這類變化點在發 酵過程中普遍存在，不僅有著明確的生物學意義，而 且具有非常重要的應用價值 。可將發酵過程中這類 變化速率顯著改變 的 點，以及發生方向性改變的轉 折點統稱為臨界變化點，簡稱“臨界點”，其特征是發 酵體系發生了從一個狀態到另一個狀態的改變，亦 或從一個階段到另一個階段的改變 。
應用發酵尾氣分析技術進行實時連續 在 線 監 測，可方便 、直觀地獲得發酵過程中的臨界點 。這些 臨界點提供的豐富信息可以幫助人們辨識發酵過程 狀態，為 調 整 攪 拌 轉 速／通 氣 量 、流 加 補 料 、基 因 誘 導，以及異常 發酵處理等一系 列 工藝操 作提供 明確 指導，同時也為工藝放大提供對比數據 。充分重視和 利用這些臨界點信息對優化發酵工藝具有重要意義 。
2．2 利用發酵過程臨界點指導操作
2．2．1 利用臨界點調整供氧
溶解氧是好氧發酵微生物生長及產物合成所必 需的 。在發酵過程 中，特 別是在高密度工程菌培養 中，溶解氧往往 成 為 限 制 性 因 素 。 如何適時調整攪 拌轉速和通氣量以達到最適溶解氧，是 發 酵 工 藝 的 關鍵點之一[15－17] 。 一般根據溶解 氧 DO、pH 及 鏡 檢 結果等進行調整，比較粗放，而利用尾氣分析曲線的 臨界點，則可以準確把握調整時機 。
在山東省科學 院 生 物 研 究 所 承 擔 的“植 酸 酶 工 程菌高密度發酵智能控制關鍵技術”(山東省重點研 發計劃項目 2016ZDJS07A20) 項 目 中，在 10L 實 驗 室發酵罐上，采用 FGA 發 酵 尾 氣 分 析 儀，對 重 組 畢 赤酵母表達植酸酶過程進行實時在線檢測 。 發酵溫 度 30 ℃，初 始 發 酵 液 體 積 7L，通 氣 量 5L／min，攪拌轉速 200r／min 。 發酵 6h5min 時，CER 開 始 緩 慢上升；發 酵 25h26 min 時，CER 出 現 快 速 上 升， 曲線上形成明顯的 臨 界 點，預示發 酵進入對數生長 期，此時 立刻調整攪拌轉速至 400r／min；之 后 隨 著 CER 的上升，階段性小步調整攪拌轉速達 530r／min， 并保持至 發 酵 48h30 min，之 后調整攪拌轉速至 500r／min，直至 發 酵 結 束 。 該 發 酵 過 程 的 CER 變 化曲線如圖 1 所示 。在該過程中，發 酵 15h 時 進 行 甲醇誘導，誘 導 5h 后 開 啟 蛋 白 表 達，SDS－PAGE 檢 測植酸酶表達見文獻[18]，最終酶活達 3 000U／mL。
摘要：發酵尾氣分析技術在業內的應用已逐漸展開，但人們對單通道檢測的認識依舊模糊 。從尾氣分析的意義、生物過程的“實時性”以及發酵過程的“臨界點”反映發酵狀態的改變等方面，闡述了發 酵尾氣分析應采用實時、連續、在線檢測；通過以尾氣分析獲得的“臨界點”在發酵工程中的應用(指 導轉速調整、流加補料、乳糖誘導及處理異常發酵)，進一步闡明只有單通道檢測才能真正做到檢測 的實時、連續、在線，捕捉到有價值的“臨界點”信息。
關鍵詞：發酵；尾氣分析；單通道；檢測
中圖分類號：Q819 文獻標志碼：A 文章編號：1674－2214(2022)04－0217－05 DOI:10. 16774/j.cnki.issn. 1674-2214.2022.04.009
Discussion on the application ofsingle channel detection in fermentation tail gas
analysis
GONG Weili1，2， LIU Zhonghui1，2， MA Yaohong1，2， SHI Jianguo1，2
(1．Qilu University of Technology (Shandong Academy of Sciences)， Biology Institute，Jinan 250014， China；
2．Shandong Provincial Key Laboratory of Biosensors，Jinan 250014， China)
Abstract： The technology of fermentation tail gas analysis has been gradually developed and applied in the industry，but single－channel detection is still poorly understood．In this paper，we expounded that fermentation tail gas analysis should adopt real－time continuous online detection from the significance of fermentation tail gas analysis，the “real－time”of biological process，and the critical point of fermentation tail gas analysis curve reflecting the change information of process state，and the critical point obtained from tail gas analysis in fermentation engineering (guidance of speed adjustment，flow feeding， lactose induction and treatment of abnormal fermentation) illustrated that only single channel detection can achieve real－time，continuous and online detection，and capture valuable “critical point”information．
Keywords： fermentation； tail gas analysis； single channel； detection
收稿日期：2022－09－01
基金項目：齊魯工業大學科教產融合試點工程基礎研究類基金資助項目 (2022PY067)；齊魯工業大學科教產重大創新專項(2022JBZ01－06)； 山東省重點研發計劃項目 (重大關鍵技術)(2016ZDJS07A20)
作者簡介：公維麗(1988 — )，女，山東臨沂人，副研究員，研究方向為生物傳感器技術 、微生物發酵工程，E－mail：15264110812＠163．com。
通信作者：劉仲匯高級工程師，E－mail：sws2605384＠163．com。
發酵尾氣分析指在發酵過程中在線檢測尾氣中 的 CO2 和 O2 的體 積 分 數，計 算 呼 吸 代 謝 參 數 CO2 釋放率(Carbon dioxide evolution rate，CER)、攝 氧 率(Oxygen uptake rate，OUR) 和 呼 吸 商 (Respira－ tory quotient，RQ)，得到細胞代謝信息，是發酵工程 的一種過程分析技術(Process analysis technology， PAT)。 無論 是 在 微 生 物 生 長 階 段，還 是 在 產 物 合成階段，CER 的變化都與菌 體 生 長 狀 態 、碳 源 的 消耗和供氧情 況 密 切 相 關 。 OUR 雖然取決于菌體濃度，但是也與發酵 液 的 營 養 成 分 、溶 氧 水 平 、菌 體 的比生長 速 率 以 及 碳 源 的 種 類 和 濃 度 等 因 素 有 關 。RQ的變化反 映 了 微 生 物 胞 內 代 謝 的 變 化，揭 示 了發酵過程中微觀代謝途徑通量的變化，是 微 生 物 菌體生長 、能量代謝維持 、產物和副產物合成代謝共同作用的結果[1－7] 。利用這些參數及相關性分 析，可 以 更好地對發酵過程進行監測 、分析，從而深入了解發 酵規律，優化發酵 工 藝，控 制 發 酵 過 程，提 高 發 酵 產 率和產量，降低成本，加快新品研發和產業化 。
與溶解氧和 pH 檢 測 相 比，尾 氣 分 析 得 到 的 參 數 CER，OUR 和 RQ 在 一定 程度上反映了發酵過 程的部分特質，揭示了微生物的生理特性，具有生物 學意義 。尾氣分析時僅采集 發酵罐排出的尾氣，不 影響發酵罐 結 構，不 接 觸 發 酵 液，無 染 菌 風 險[8－10]， 更容易被業界接受，故成為現代發酵工程的重要分析 手段，已被應用于發酵、制藥、生化、農業、環保和食品 等領域 。 雖然該技術已在業內得到應用，但是由于歷 史原因以及設備成本等因素的影響，對檢測設備是否 需要采用獨立的單 通 道，認 識 依 舊 模 糊 。 因 此，筆 者 從理論與實際應用兩方面對該問題加以分析探討 。
1 發酵尾氣分析應實時連續在線
在 發 酵 過 程 中，微 生 物 生 長 一 般 需 要 經 歷 遲 緩 期 、對數生 長 期 、穩 定 期 和 衰 亡 期[11] 。 常 規 的 液 態 好氧分批發酵周期一般為數小時至數天 。在看似較 長的發酵過程中，發酵狀態的轉變 往往發生在很短 的時間內，某些代謝變化可能用時更短 。
張嗣良等 在《多 尺 度 微 生 物 過 程 優 化》[12] 及 相 關論 文[13] 中 詳細闡述了生 物 過 程 的 “實 時 性 ”： 1) 從生物 過程發生的時 間以及 生物技術發展特點 來看，對于以活細 胞為主體的細胞 大規模培養的生 物反應過程，可粗分為在以基因水平的分子尺度 、代 謝調節的細胞尺度和工藝控制的反應器尺度上發生 的；2) 可將微 生 物 和 細 胞 在 酶 活 性 水 平 上(包 括 酶 的激活 、抑制，亞基的結合和解離以及共價修飾和降 解) 控制的時間常數描述在毫秒至秒的范圍內，在基 因表達調控水平上(誘 導 、轉 錄的阻遏和去阻遏) 描 述至分鐘 。考察微 生 物 和 細 胞 代 謝 調 節，在 以 秒 為 單位的時間尺 度 上 是 合 適 的 。 因 此，作 為 動 態 觀 測 記錄細胞代謝狀況 的 發 酵 尾 氣 分 析 設 備，應 對 排 出 的尾氣進行實時連續在線檢測，只有這樣，才能準確 捕捉到發酵過程中代謝的改變 。
2 合理利用發酵過程中的臨界點
2．1 發酵過程中的臨界點
李強等[14] 在《微生物發酵 中 二 氧 化 碳 釋 放 速 率 變化規律》中，通過青霉素 、古龍酸 、二元酸和葡萄糖 酸 4 個體系的發酵實驗及動力學分析，對 CER 的變化規律進行了探 究，研 究 結 果 表 明：無 論 是 霉 菌 、酵 母菌 、細 菌 、單 液 相 體 系 、雙 液 相 體 系，還 是 純 種 發 酵 、混合菌發 酵，CER 的 變 化 都 與 體 系 狀 態 變 化 有 著密切聯系；CER 曲線上的轉 折 點 對 應 的 就 是 發 酵 狀態的轉變點 。 由該文獻的 CER 曲線可以發現：在 這些轉折點處曲線發生了方向性改變，即 由 升 轉 為 降，或者由降轉為 升，曲線出現明顯的峰或谷，發 酵 體系的狀態都發生了顯著改變 。
在發酵過程中還存在另一類極具價值 的 變 化 點，即發酵體系的狀態變化由緩慢到快速，或由快速 轉為緩慢的時間點，比如在微生物生長由遲緩期進 入對數生長期，由 對數生長期進入穩定期以及由穩 定期進入衰亡期的那些時間點上，都有可能出現該 情況 。在這類時間點上，雖然發酵體系的 CER 曲線 沒有發生方向性改 變(由 升到降或由降到升)，但 是 發生了變化速率的 顯 著 改 變，或者說發生了從一個 發酵階段轉變到另一個發酵階段 。這類變化點在發 酵過程中普遍存在，不僅有著明確的生物學意義，而 且具有非常重要的應用價值 。可將發酵過程中這類 變化速率顯著改變 的 點，以及發生方向性改變的轉 折點統稱為臨界變化點，簡稱“臨界點”，其特征是發 酵體系發生了從一個狀態到另一個狀態的改變，亦 或從一個階段到另一個階段的改變 。
應用發酵尾氣分析技術進行實時連續 在 線 監 測，可方便 、直觀地獲得發酵過程中的臨界點 。這些 臨界點提供的豐富信息可以幫助人們辨識發酵過程 狀態，為 調 整 攪 拌 轉 速／通 氣 量 、流 加 補 料 、基 因 誘 導，以及異常 發酵處理等一系 列 工藝操 作提供 明確 指導，同時也為工藝放大提供對比數據 。充分重視和 利用這些臨界點信息對優化發酵工藝具有重要意義 。
2．2 利用發酵過程臨界點指導操作
2．2．1 利用臨界點調整供氧
溶解氧是好氧發酵微生物生長及產物合成所必 需的 。在發酵過程 中，特 別是在高密度工程菌培養 中，溶解氧往往 成 為 限 制 性 因 素 。 如何適時調整攪 拌轉速和通氣量以達到最適溶解氧，是 發 酵 工 藝 的 關鍵點之一[15－17] 。 一般根據溶解 氧 DO、pH 及 鏡 檢 結果等進行調整，比較粗放，而利用尾氣分析曲線的 臨界點，則可以準確把握調整時機 。
在山東省科學 院 生 物 研 究 所 承 擔 的“植 酸 酶 工 程菌高密度發酵智能控制關鍵技術”(山東省重點研 發計劃項目 2016ZDJS07A20) 項 目 中，在 10L 實 驗 室發酵罐上，采用 FGA 發 酵 尾 氣 分 析 儀，對 重 組 畢 赤酵母表達植酸酶過程進行實時在線檢測 。 發酵溫 度 30 ℃，初 始 發 酵 液 體 積 7L，通 氣 量 5L／min，攪拌轉速 200r／min 。 發酵 6h5min 時，CER 開 始 緩 慢上升；發 酵 25h26 min 時，CER 出 現 快 速 上 升， 曲線上形成明顯的 臨 界 點，預示發 酵進入對數生長 期，此時 立刻調整攪拌轉速至 400r／min；之 后 隨 著 CER 的上升，階段性小步調整攪拌轉速達 530r／min， 并保持至 發 酵 48h30 min，之 后調整攪拌轉速至 500r／min，直至 發 酵 結 束 。 該 發 酵 過 程 的 CER 變 化曲線如圖 1 所示 。在該過程中，發 酵 15h 時 進 行 甲醇誘導，誘 導 5h 后 開 啟 蛋 白 表 達，SDS－PAGE 檢 測植酸酶表達見文獻[18]，最終酶活達 3 000U／mL。
由圖 1 可知：在臨界點改變攪拌轉速后，細胞快 速進入對數生長期 。 實驗中根據臨界點及曲線變化 趨 勢，恰 當 掌握攪拌轉速 調 整時機，滿 足 供 氧 需 求，使植酸酶表達量及酶活均達較高水平 。
2．2．2 利用臨界點進行補料
流加補料－分 批 發 酵[19－23] 是現代發酵工 程 普 遍 采用的方式，可以較好地解決底物阻遏，按設備能力 供氧，減緩代謝有害物的不利影響；尤其對于基因工 程菌高密度發酵，流加補料是實現高密度發酵必不 可少的手段 。流加補料技術的關鍵是對補料時機的 把握，利用發酵尾 氣分析曲線中的臨界點能夠比較 精準地掌控補料時機 。
某大型藥企在重 組 大 腸 桿 菌培養白細 胞 介 素－ Ⅱ 生產過程中，在 1t 生產罐上應用 FGA 發酵尾 氣 分析儀，監測尾 氣 變 化，其 發 酵 過 程 CER 曲 線 如 圖 2 所 示 。 由 圖 2 可 以 看 出 CO2 的 整 體 變 化 規 律： 1) 發酵開 始 后，CER 先 有 極 短 的 平 緩 區，很 快 在 1h32min時曲線 出 現 快 速 上 升 的 臨 界 點，預 示 重 組大腸桿菌生長進入對數生長期，此時開始流加補 料，并根據 DO反饋值調整攪拌轉速，保 持 DO 在 較 高水平 。2) 在 CER迅速上升的對數生長期，逐漸提 高流加補料速率，在達到峰值，出現臨界點時，流加速 率達到最大 。3) 在 發 酵 后 期，補 料 速 率 維 持 在 某 一 穩定水平，直至發酵結 束 。整 個 發 酵 過 程 約 10h，產 物表達量 占 菌 體 總 蛋 白 的 40％ 。 發 酵 過 程 中 對 數 生長期起點和終點(臨界 點) 的 出 現 都 發 生 在 1 min 內，如非采用實時連續在線檢測是難以觀察到的 。
2．3 利用臨界點進行誘導
在重組大 腸 桿 菌 發 酵 過 程 中，通 常 采 用 IPTG 誘導劑進 行 誘 導 。 IPTG 誘 導 劑 具 有 一 定 毒 性，對宿主和代謝產物有抑制作用，且 費 用 高 昂，在 工 業 化 大規模生產中較難推廣 。乳糖是一種廉價資源，可以 作為碳源被大腸桿菌代謝利用，有報道在重組蛋白培養中用其作誘導劑，但尚不普遍，究其原因，除誘導機 理復雜外，乳糖誘導時機不易把握也是重要因素 。
張毅 等[24] 在 LB 培 養 基 中，分 別 在 對 數 生 長 期 的早 期 、中 期 以 及 后 期 對 融 合 蛋 白 表 達 菌 BL21 (DE3)(pFu) 進行 乳 糖 誘 導，發 現：乳糖的加入會造 成菌體生長遲滯，在 早 期 、中 期 進 行誘導均不理想， 只有在后期進行誘 導 效 果 最 佳，此 時既可以得到較 高的表達產物，又可以獲得較高 的 菌 體 密度 。 有 研 究報道[22－30] 表明：在培養基葡萄糖剛剛耗盡，細胞濃 度增加緩慢或略有下降時開始誘導，效果最佳 。
應 用 發 酵 尾 氣 分 析 技 術，可 以 直 觀 地 辨 識 菌 體 生長的各個階 段 。 一般在對 數生長期的后期，即 培 養基中葡萄糖剛剛 耗 盡，細胞濃度增加緩慢或略有 下降時，尾氣分析的 CER 曲線會出現一個由上升轉 為下降的臨界點，利用該臨界點可 以方便地確定誘 導時機，及時進行乳糖誘導 。
2．2．4 利用臨界點處理異常發酵
雖然微生物發酵是一個非線性時變系統，包含了 生物、化學及物理的各種變化，過程較為復雜，但是當 各 種 條 件 固 定 后，微 生 物 細 胞 代 謝 又 遵 循 一 定 的 規 律 。從發酵尾氣分析得到的大量數據來看，在某種發 酵體系中，當工藝條件確定后，其 分析曲線整體形態 是確定的，一旦發生改變，通常 預 示著某種代謝的改 變 。 因此，捕捉那些異 常 臨 界 點，對異常發酵的及早 發現和處理很有意義，特別是對工業大生產和高附加 值的生物制藥更是如此 。就此而言，尾氣分析的敏感 性和實用性均超過了 pH 、DO等其他現有檢測手段 。
在廣東某高校進行的重組大腸桿菌發酵 藥 物 蛋 白實驗中，發酵開始后，經過短暫的遲緩期，CO2 曲線 開始緩慢上 升，約 2h 后 發 酵 快 速 進 入 對 數 生 長 期； 20min后，CO2 曲 線 突 然 出 現 了 下 折，CO2 體積分數 迅速下降，在不到 30min 的時間內下降到接種前水平， 鏡檢觀察，發現此時發酵液中的工程菌已經消失，判斷 感染了噬菌體，隨即停止發酵，并迅速進行滅菌處理。 該實驗過程的 CO2 體積分數變化曲線如圖 3 所示。
3 實時連續在線檢測
3．1 實時連續在線檢測的意義
利 用 發 酵 尾 氣 分 析 技 術，特 別 是 利 用 分 析 曲 線 上的臨界點，監測發酵過程中細胞的代謝變化，可以 為發酵操作及進一步工藝優化提供 依 據 。 發酵尾氣 分析技術的關鍵在于對發酵過程中尾氣的 CO2 及 O2 進行實時連續在線監測，只有這樣才能捕捉到發酵狀 態改變的臨界點，監測到細胞代謝狀態的改變 。 由于 發酵過程中臨界點的出現和狀態的改變往往 發 生 在 極短的時間內，所以實時連續在線檢測尤為重要 。
3．2 采用單通道確保實時連續在線檢測
隨 著 現 代 科 技 的 發 展，發 酵 尾 氣 分 析 所 采 用 的 各檢測部件本身的響應時間非常短，一般在毫秒級， 但從發酵罐排氣口到檢測腔，尾氣的傳輸需要時間， 相比之下檢測時間 可 忽 略 不 計，故完成一次檢測的 時間主要取決于尾氣的傳輸時間 。
雖然采用一套檢測部件加轉換開關對多 套 發 酵 設備分時切換輪巡檢測的方式，可以實現一套尾氣分 析系統測定多點尾氣，降低發 酵 設 備 的 平 均 成 本，但 是在切換過程中，氣路轉換無 法 瞬 間 完 成，必 須 反 復 用后一通道的尾氣頂出前一通道的尾氣，會造成尾氣 混合帶來檢測誤差，此外還存 在 傳 輸 時 間 長 、信 號 延 時等問題，也增加了 染 菌 風 險 。 因 此，在 進 行 發 酵 尾 氣分析檢測時，應 該 采 用 獨 立 的 單 通 道 檢 測，即一套 檢測設備連接一個發酵罐，唯有采用此方式才可以實 現實時連續在線檢測，捕捉到那些極其重要的臨界點。
4 結 論
應用發酵尾氣分析技術可以深入了解細胞的代 謝狀況 。分析曲線上的“臨界點”往往反映了發酵過 程狀態的改變，對研究發 酵工藝至關重要 。 要 捕 捉 這些臨界點就需要進行實時連續在線檢測，唯 有 采 用獨立的單通 道檢測方能做到 。 目 前，發 酵 尾 氣 分 析技術日臻成熟，尾氣分析裝置也成為發酵罐的標 準配置 。 隨著設備的普及和尾氣分析在多方面應用 的深入開展，業界對其應用效果的期望愈來愈高，單 通道檢測 在發酵尾氣分析中 的 意 義 會 日 益 清 晰 明 了，該檢測方式有望被業界廣泛接受 。
參考文獻：（略）
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