µ-Slide 8 Well高腔蓋玻片在鈣成像研究細胞信號轉導的應用
鈣是影響多種細胞過程的重要信使，包括細胞遷移、交流和對刺激物或異物作出反應的能力。由于其在細胞功能中的重要性，細胞內的鈣（稱為細胞內鈣）受到高度調節。鈣主要儲存在細胞器內，例如內質網和線粒體，并根據特定信號釋放。這種嚴格的調節使細胞內鈣成為了解細胞功能和信號動力學的絕佳工具。
鈣：細胞過程的多功能指示劑
有幾種細胞內鈣的熒光指示劑可用于研究細胞功能。這些指標使研究人員能夠檢查傷口愈合、傳染病、藥物治療等過程中的細胞反應。
在我們的實驗室中，我們使用鈣信號作為讀數來了解病毒在感染過程中利用宿主信號反應的能力，并剖析所涉及的信號通路。為此，我們利用含有熒光鈣指示劑的細胞活細胞成像，其中熒光的增加表明細胞內鈣的增加。
輪狀病毒感染的非洲綠猴腎細胞 (MA104) 的活細胞成像。MA104 細胞，以綠色顯示，表達鈣指示劑 GCaMP6s，其中綠色增加表示細胞內鈣增加。在這個活體細胞成像視頻中，輪狀病毒感染的細胞呈紅色——Hyser 實驗室此前曾報道，在輪狀病毒感染期間，輪狀病毒會導致受感染細胞中的細胞內鈣增加，隨后激活鄰近細胞中的特定信號通路，從而引起未感染細胞的細胞內鈣信號 (Chang-Graham et al., 2020)。
鈣指示劑的種類及應用：
鈣指示劑主要分為兩大類：化學指示劑（即染料）和基因編碼的鈣指示劑（即鈣指示劑被編碼到細胞系、動物模型或系統中）。鈣指示劑已用于使用顯微鏡、高通量篩選和流式細胞術進行的體內和體外工作。然而，我們將專注于使用顯微鏡在體外可視化和量化鈣信號。用于活細胞成像實驗的鈣指示劑類型取決于預期的細胞系、成像長度以及定性或定量數據的預期結果等因素。
1. 預期細胞系：
對于原代細胞系，直接的方法是使用熒光染料（化學指示劑），其中熒光鈣指示劑被簡單地添加到培養的細胞中，并可以在孵育期后成像。這些染料也是首次實驗收集初步數據的極好方法。使用熒光染料時的一個重要提示是在添加之前和之后徹底清洗細胞，因為染料會導致高背景熒光，使得在顯微鏡和活體成像期間更難以正確聚焦細胞。
與基因編碼的鈣指示劑相比，熒光染料通常更亮、更穩定。然而，染料通常不如遺傳傳感器特異，并且可以具有更高的背景熒光。在活細胞成像中，熒光染料（包括 Fura-2AM、Fluo-4AM、Indo 1AM 等）可以有效地進行短期活細胞成像。一個潛在的警告是，在某些細胞中，細胞可能會保留染料或無法正確加載到某些細胞類型或亞群中。此外，隨著時間的推移，細胞傾向于抽出染料。雖然添加陰離子轉運蛋白抑制劑可以防止細胞泵出染料，但這些抑制劑可能對某些細胞類型具有細胞毒性，如果使用其他治療方法評估鈣信號的變化，可能會使情況復雜化。鈣染料的一個重要考慮因素是使用抑制劑還是激動劑。抑制劑和激動劑也可能影響鈣染料反映類似于天然組織中的表達的能力。
在用 ADP 進行激動劑治療期間，人腸道類器官單層的實時、短期成像。這些有機體單層以綠色表達鈣指示劑 GCaMP6s。ADP 是一種已知的激動劑，用于在細胞中引發細胞內鈣信號傳導。激動劑治療是測試治療劑量反應的極好方法。
2. 成像長度
時機就是一切。對于活細胞成像，時間長度和間隔是需要牢記的重要參數。成像過程中的主要問題是光漂白和光毒性。應避免連續應用激發光，重要的是選擇足夠強的曝光時間和光功率來檢測鈣信號，但不要過強，以免對細胞造成損害。成像的長度將取決于實驗。對于測試激動劑或細胞反應，這通常是 5-20 分鐘的較短成像運行，每 1-2 秒捕獲一次圖像。對于研究傷口修復或病毒感染期間鈣信號傳導的實驗，我們會在 18-20 小時內成像，每分鐘捕捉一次圖像。
輪狀病毒感染的非洲綠猴腎細胞 (MA104) 的活細胞成像。MA104 細胞，以綠色顯示，表達鈣指示劑 GCaMP6s，其中綠色增加表示細胞內鈣增加。在這個活細胞成像視頻中，輪狀病毒感染的細胞呈紅色——Hyser 實驗室此前曾報道，在輪狀病毒感染期間，輪狀病毒會導致受感染細胞中的細胞內鈣增加，隨后激活鄰近細胞中的特定信號通路，從而引起未感染細胞的細胞內鈣信號。
鈣成像LED光源
pE-340 fura和pE-800 fura提供了最全面的鈣成像系統，強大而高效的 LED 提供 340-635 nm 的光譜覆蓋范圍，適用于所有流行的鈣指示劑、pH 指示劑、視蛋白以及從 Fura-2 到 Cy5 的日常熒光熒光團。通過 USB、TTL 或模擬實現對所有八個通道的單獨控制，以便輕松地將每個 LED 與選定的鈣指示劑或熒光團組匹配。與激光不同，LED 更寬的光譜輸出可以通過使用濾光片進行細化，以激發一系列染料，從而擴大的覆蓋范圍。使用新的 LED 照明光源，可以將更少的 Fura-2 染料加載到細胞中，同時仍保持相同的測量鈣濃度和良好的信噪比。由于染料毒性降低，所需染料的減少不僅提高了細胞活力，而且還降低了每次實驗的成本,通過波長切換和濾光片定制波長輸出的能力意味著實驗不再受光源的限制，即使在未來需求發生變化或新染料出現時也是如此。
活細胞成像的技巧
考慮要使用的細胞系很重要。為了研究鈣動力學（或其他細胞信號），使用形成為單層的細胞系將確保感興趣的區域將保持聚焦以捕獲信號動力學以獲得最佳視頻質量和干凈的量化。對于涉及細胞間通訊和鈣動力學的實驗，細胞系匯合度也是一個重要的考慮因素。為了獲得最佳質量的成像，選擇合適的載玻片非常重要。有些細胞培養物更喜歡玻璃而不是光學級塑料載玻片，因此最好測試腔室載玻片。我們為我們的細胞系使用ibiTreat µ-Slide 8 Well高腔蓋玻片。
µ-Slide 8 Well high（貨號80806）
對于活細胞成像，重要的是以允許形成融合的單層但不會導致細胞過度擁擠和結塊的密度對細胞進行鋪板。最后一個技巧是在成像過程中使用合適的介質。許多傳統細胞培養基含有酚紅，會導致高背景熒光。這使得在成像過程中很難將真實信號與背景噪聲分開。因此，用 PBS 清洗細胞并用無酚紅培養基或用于活細胞成像的市售培養基替換培養基非常重要。
毒胡蘿卜素治療前后非洲綠猴腎細胞 (MA104) 的活體短期成像。MA104 細胞，以綠色顯示，表達鈣指示劑 GCaMP6s，其中綠色增加表示細胞內鈣增加。毒胡蘿卜素是一種眾所周知的肌細胞/內質網 Ca2+-ATP 酶抑制劑（這對于從胞質溶膠中螯合鈣很重要）。通過這種抑制作用，毒胡蘿卜素誘導內質網應激，并可導致源自內質網的細胞內鈣增加。
參考：
Chang-Graham AL, Perry JL, Engevik MA, Engevik KA, Scribano FJ, Gebert JT, Danhof HA, Nelson JC, Kellen JS, Strtak AC, Sastri NP, Estes MK, Britton RA, Versalovic J, Hyser JM. Rotavirus induces intercellular calcium waves through ADP signaling. Science. 2020 Nov 20;370(6519):eabc3621. doi: 10.1126/science.abc3621.
