細胞爬片全過程操作詳解
在做免疫熒光（IF），激光共聚焦(Confocal)，凋亡檢測（TUNEL）時，免不了要制備細胞爬片，爬片質量決定了最后拍照的質量以及實驗數據的精準性。細胞爬片就是讓玻片浸在細胞培養基內，細胞在玻片上生長。主要用于組織學，免疫組織化學，冰凍切片，細胞涂片，原位雜交等。
一、細胞爬片的準備：
1、蓋玻片的選擇：
爬片可用一般的蓋玻片，也可用專用細胞爬片（價格比較昂貴）但是細胞貼壁牢固，拍出照片效果好；
2、爬片的剪裁：
可根據自己的需要，到染色時再將之切開，這樣既保證了細胞均一性，又可同時做幾個指標的染色剪裁成合適大小，置于6孔板、12孔板或24孔板；
3、爬片的使用前處理：
將剪裁好的爬片，置于濃硫酸中浸泡并過夜，第二天先用自來水沖洗20遍，再置于無水酒清中浸泡6小時，再用三蒸水沖洗3遍（個人認為主要目的是將酸沖洗干凈就可以了，如果不干凈的話，細胞帖壁不好），放在飯盒或者玻璃培養皿中烘干后進行高壓消毒。高壓后取出放入烤箱中烤干，備用。烤干后可放入超凈臺中。
4、多聚賴氨酸的使用：
很多人都將玻片用此處理，以使細胞與玻片結合更牢。但我在做爬片時從來沒用過多聚賴氨酸，細胞貼壁仍然很好，且在做后續的免疫細胞化學染色、TUNEL等凋亡檢測、免疫熒光等也從未脫過片。
二、細胞爬片的操作：
1、胰酶消化細胞后計數重懸細胞于完全培養基中。
2、加細胞前，根據玻片的大小，先在每個孔里準備放爬片的位置滴少量培養基，使玻片與培養皿靠培養基的張力粘合到一起，然后放玻片，防止加細胞懸液時玻片漂起，造成雙層細胞貼片。(整個過程注意無菌操作)
3、根據自己的需要選擇合適的細胞密度接入培養板內即可。
4、待細胞貼壁后，可去上清加含藥培養基。
5、按照實驗設計，作用一定時間后取玻片。取玻片時由于玻片與培養皿底結合較緊，張力較大，一般將注射器針頭針尖向背面弄個小鉤，這樣將爬片輕輕勾起，用小鑷子取出就可以了。如果要做諸如24h，48h，72h等這樣時間點的實驗的話，將所需數量的爬片取出時應用酒精燈火焰燒一下針頭和鑷子。末取出的可接著繼續培養。
三、細胞爬片的固定：
另外在保存細胞爬片的時候，一般用培養皿或板，先在皿底放一層面巾紙，然后再放爬片，這樣方便做實驗時取片。
細胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后再做固定。當然，有例外，比如做凋亡的TUNEL染色時就避免洗，因為凋亡的細胞在洗的過程中有可能會脫落。
然后蓋上蓋子，并在蓋子上做標記，為避免混淆，可用透明膠帶將蓋子和皿連在一起。一般-20℃保存2-3個月的片子做免疫組化是沒有問題的。
四、細胞進行爬片注意事項：
一、細胞爬片的準備：
1、蓋玻片的選擇：
爬片可用一般的蓋玻片，也可用專用細胞爬片（價格比較昂貴）但是細胞貼壁牢固，拍出照片效果好；
2、爬片的剪裁：
可根據自己的需要，到染色時再將之切開，這樣既保證了細胞均一性，又可同時做幾個指標的染色剪裁成合適大小，置于6孔板、12孔板或24孔板；
3、爬片的使用前處理：
將剪裁好的爬片，置于濃硫酸中浸泡并過夜，第二天先用自來水沖洗20遍，再置于無水酒清中浸泡6小時，再用三蒸水沖洗3遍（個人認為主要目的是將酸沖洗干凈就可以了，如果不干凈的話，細胞帖壁不好），放在飯盒或者玻璃培養皿中烘干后進行高壓消毒。高壓后取出放入烤箱中烤干，備用。烤干后可放入超凈臺中。
4、多聚賴氨酸的使用：
很多人都將玻片用此處理，以使細胞與玻片結合更牢。但我在做爬片時從來沒用過多聚賴氨酸，細胞貼壁仍然很好，且在做后續的免疫細胞化學染色、TUNEL等凋亡檢測、免疫熒光等也從未脫過片。
二、細胞爬片的操作：
1、胰酶消化細胞后計數重懸細胞于完全培養基中。
2、加細胞前，根據玻片的大小，先在每個孔里準備放爬片的位置滴少量培養基，使玻片與培養皿靠培養基的張力粘合到一起，然后放玻片，防止加細胞懸液時玻片漂起，造成雙層細胞貼片。(整個過程注意無菌操作)
3、根據自己的需要選擇合適的細胞密度接入培養板內即可。
4、待細胞貼壁后，可去上清加含藥培養基。
5、按照實驗設計，作用一定時間后取玻片。取玻片時由于玻片與培養皿底結合較緊，張力較大，一般將注射器針頭針尖向背面弄個小鉤，這樣將爬片輕輕勾起，用小鑷子取出就可以了。如果要做諸如24h，48h，72h等這樣時間點的實驗的話，將所需數量的爬片取出時應用酒精燈火焰燒一下針頭和鑷子。末取出的可接著繼續培養。
三、細胞爬片的固定：
另外在保存細胞爬片的時候，一般用培養皿或板，先在皿底放一層面巾紙，然后再放爬片，這樣方便做實驗時取片。
細胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后再做固定。當然，有例外，比如做凋亡的TUNEL染色時就避免洗，因為凋亡的細胞在洗的過程中有可能會脫落。
然后蓋上蓋子，并在蓋子上做標記，為避免混淆，可用透明膠帶將蓋子和皿連在一起。一般-20℃保存2-3個月的片子做免疫組化是沒有問題的。
四、細胞進行爬片注意事項：
1. 使用細胞爬片時（比如在六孔板中放入爬片，六孔板的孔底面積往往會比爬片面積多出一部分，加細胞懸液時常常就是細胞鋪滿整個孔底，有時細胞生長邊集現象，就是靠近壁邊緣密度要高些，這樣處于中央玻片上爬的細胞數量就可能相對較少）。比較好的做法是將玻片放入孔板的孔內后，加細胞懸液時只滴到玻片上，一直滴到液體布滿整個玻片又不會溢出玻片邊緣。
2. 按照實驗設計，作用一定時間后取玻片。注意細胞不能太密，否則容易掉片。
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