PEAKS AB軟件在ADC藥物偶聯位點表征的應用
編者按：
抗體-藥物偶聯物（ADC）是通過化學連接子將效應分子與單克隆抗體（mAbs）結合而形成的。對ADC的關鍵質量屬性（CQA），如藥物抗體比（DAR）、藥物負荷分布和藥物結合位點進行全面評估對藥物開發至關重要。其中，藥物結合位點由于影響ADC的穩定性和藥代動力學受到廣泛關注，然而，由于技術挑戰，很少有研究關注這一領域的方法開發。
2023年2月，來自中國科學院上海藥物所的團隊在Analytica Chimica Acta（IF=6.911）發表了題為“Conjugation site characterization of antibody–drug conjugates using electron-transfer/higher-energy collision dissociation (EThcD)”的文章。EThcD碎裂模式（將電子轉移裂解（ETD）和高能碰撞解離（HCD）相結合）產生的碎片離子比傳統的HCD碎片更多，這有助于識別和定位翻譯后修飾。在EThcD碎裂模式下，作者使用PEAKS AB分析軟件表征ADC藥物的結合位點，包括隨機偶聯和位點特異性偶聯，此研究可能有助于各種臨床前和臨床ADC的質量控制。
ADC藥物結合位點分析難點：
1、效應分子通常具有高度疏水性，導致效應分子偶聯的肽段在液相色譜分離過程中洗脫時間更晚。
2、與其他類型的PTM相比，效應分子相對較大且結構復雜（約1000-2000 Da）。
3、效應分子容易受到碰撞誘導的碎片化的影響，會顯著削弱偶聯肽段的電離效率。這對質譜分析結果的重現性造成影響。
肽圖分析方法優化：
采用T-DM1樣品作為ADC模型，包含92個潛在的結合位點，包括88個賴氨酸殘基和4個N-末端氨基。由于結合位點多，小分子偶聯的隨機性強，增加了分析難度。作者優化了關鍵的LC–MS/MS參數以滿足分析需求，包括液相色譜梯度、動態排除、AGC和IT。
1、在調整液相色譜梯度時，作者考慮了總的二級肽段譜圖數（PSMs）和效應分子偶聯PSMs之間的平衡。對比了兩種不同梯度條件下的DM1偶聯肽段的PSMs的數量，發現梯度2條件下的效應分子偶聯PSMs被更有效地分離（圖1B）。這樣可以減少共溶并改善了偶聯肽段的質譜檢測質量。
2、設置動態排除過濾已經碎片化的母體離子，提高低豐度偶聯肽段的檢測。因此，在HCD條件的基礎上，AGC和IT增加20%時，偶聯肽段MS/MS譜圖的比例有所增加（圖1C）。
1、在調整液相色譜梯度時，作者考慮了總的二級肽段譜圖數（PSMs）和效應分子偶聯PSMs之間的平衡。對比了兩種不同梯度條件下的DM1偶聯肽段的PSMs的數量，發現梯度2條件下的效應分子偶聯PSMs被更有效地分離（圖1B）。這樣可以減少共溶并改善了偶聯肽段的質譜檢測質量。
2、設置動態排除過濾已經碎片化的母體離子，提高低豐度偶聯肽段的檢測。因此，在HCD條件的基礎上，AGC和IT增加20%時，偶聯肽段MS/MS譜圖的比例有所增加（圖1C）。
圖1 | 肽圖分析工作流程和分析T-DM1的LC–MS/MS參數優化。通過EThcD表征ADC隨機偶聯位點
使用EThcd碎裂方式分析T-DM1偶聯位點，在62個軟件鑒定的結合位點中，58個（16個在輕鏈，42個在重鏈）具有DM1相關的特征離子。在手動檢查MS/MS譜圖的過程中，發現一些有趣的肽段。如圖2A中，由于MS/MS譜圖中缺乏DM1特征離子，該肽段的驗證受到影響；圖2B中，肽段“SCDK（DM1）THTCPCPPELLGGPSVFLFPPKPK”具有特征離子和3個可能偶聯DM1的賴氨酸位點，但是MS/MS譜圖中沒有賴氨酸位點完全斷開的片段離子，就無法確認K4處的DM1偶聯；圖2C中，肽段“FTISATSK（DM1）NTAYLQMN”沒有觀察到特征離子，但是K9偶聯位點的片段離子有助于正確識別位點。如圖2D所示，EThcD可以準確定位K4偶聯的DM1效應分子，而HCD不能準確定位。
圖2 | 利用片段離子驗證可靠的ADC偶聯位點盡管PTM搜索可能存在很高的錯誤發現率，這項研究首次報道了使用偶聯位點的片段離子來評估軟件搜索結果。HCD和EThcD分別鑒定了近56個和46個可靠的結合位點（圖3A），不過經過手動檢查特征離子和片段離子后，EThcD鑒定到的MS/MS圖譜的可信度高于HCD。
T-DM1的賴氨酸殘基的DM1修飾可能由于空間或靜電阻礙影響了蛋白酶的水解。因此，胰蛋白酶的酶解肽段具有更多的不完全酶解和更長的肽段，這適合于使用ETD裂解�？傮w而言，EThcD可能更適合ADC結合位點的表征。
另外還發現，在EThcD下，所有手動驗證的偶聯位點的MS/MS圖譜得分略低于HCD數據（圖3D）。理論上，偶聯肽段對EThcD表現出更好的裂解。一種可能的解釋是，盡管已經調整了一些軟件工具來處理ETD數據，但EThcD數據分析中存在一些不足。首先，b/y和c/z離子序列在合并后具有更高的指定錯誤率；其次，ETD產生的非c/z碎片離子數量越高（例如帶電的還原母離子和無法解釋的峰），錯誤分配的幾率就越大。因此開發用于優化現有程序的新算法可以最大限度地發揮EThcD碎片化的優勢。
T-DM1的賴氨酸殘基的DM1修飾可能由于空間或靜電阻礙影響了蛋白酶的水解。因此，胰蛋白酶的酶解肽段具有更多的不完全酶解和更長的肽段，這適合于使用ETD裂解�？傮w而言，EThcD可能更適合ADC結合位點的表征。
另外還發現，在EThcD下，所有手動驗證的偶聯位點的MS/MS圖譜得分略低于HCD數據（圖3D）。理論上，偶聯肽段對EThcD表現出更好的裂解。一種可能的解釋是，盡管已經調整了一些軟件工具來處理ETD數據，但EThcD數據分析中存在一些不足。首先，b/y和c/z離子序列在合并后具有更高的指定錯誤率；其次，ETD產生的非c/z碎片離子數量越高（例如帶電的還原母離子和無法解釋的峰），錯誤分配的幾率就越大。因此開發用于優化現有程序的新算法可以最大限度地發揮EThcD碎片化的優勢。
通過EThcD表征ADC特異性偶聯位點
ADC-134-4是K251位點偶聯的ADC藥物，攜帶MMAE作為效應分子。其特征碎片離子為m/z 718.5，HCD碎裂傾向于裂解MMAE分子產生m/z 506.36的碎片離子。盡管圖4A中的MS/MS光譜觀察到與MMAE相關的特征離子506.36，但HCD碎裂在可能的偶聯位點K249和K251附近不存在片段離子，而EThcD 碎裂下MS/MS圖譜中的片段離子有很好的碎裂，有助于驗證偶聯位點（圖4B）。
同樣，應用HCD和EThcD表征ADC-10-2藥物偶聯位點，結果發現，與HCD相比，EThcD可以更準確地識別K252為主要結合位點（圖4C和圖4D）。
圖4 | EThcD碎裂精確定位位點特異性ADC的正確偶聯位點結論
ADC偶聯位點的表征是一個復雜但有前途的研究領域。作者結合PEAKS AB分析軟件，評估了EThcD表征ADC偶聯位點的可能性。EThcD碎裂產生了更多的主鏈斷裂，提高了修飾位點定位的精確度。與HCD相比，EThcD在隨機偶聯和特異性偶聯位點的鑒定中均觀察到更高比例的可信MS/MS圖譜。總體來說，將胰蛋白酶消化、60分鐘液相色譜分離、EThcD碎裂和PEAKS AB軟件搜索相結合來進行ADC藥物偶聯位點的表征，是ADC藥物質量控制的一種很有潛力的方法。
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