感染高危型人乳頭瘤病毒(HPV)導致全世界5%的癌癥，包括宮頸癌和口咽癌。HPV16占大多數，并且持續的角質形成細胞感染是主要的危險因素。病毒癌基因在人類致癌中的作用已經被深入研究了幾十年，分化對病毒生命周期的重要性是已知的。病毒的生命周期依賴于復層鱗狀上皮的分化程序，但支持病毒生命周期不同階段的角質形成細胞亞群的格局尚未闡明。在2023年4月，發表在Nature Communications上的“Single cell transcriptomic analysis of HPV16-infected epithelium identifies a keratinocyte subpopulation implicated in cancer”一文（中文題目：HPV16感染上皮的單細胞轉錄分析確定與癌癥有關的角質形成細胞亞群）中，研究者構建類器官并進行單細胞測序共識別出12個不同的角質形成細胞群，其中一個亞群被映射以重建它們在復層鱗狀上皮中各自的三維位置。研究發現，與傳統的終末分化細胞不同，HPV重新編程的角質形成細胞亞群(HIDDEN細胞)形成了表面區域，并需要ELF3/ESE-1轉錄因子的過度表達。
 

Visual summary

 

技術路線

 

研究內容

1. scRNAseq 揭示了 HPV16+ 與 HPV16− 復層鱗狀上皮raft中不同角質形成細胞亞群的富集

研究者首先從HPV+ 和 HPV- 靠近形成皮膚的二倍體永生化角質形成細胞 (NIKS)構建了3D類器官raft，隨后研究者對構建成功的HPV+ raft和 HPV- raft進行了單細胞測序，形成了12個角質形成細胞亞群(C0-C11)。其中C9 與其余 11 個簇唯一分離，并且在 HPV16+ 細胞中高度富集，3個簇 (C4、C5 和 C7) 富含 HPV16- 細胞，除 C9 外，C6 亞群也富含 HPV16+ rafts，而 C8 亞群只存在于 HPV16+ rafts中。

圖1 HPV16+ raft與HPV16- raft的產生
 

圖2 HPV16+ raft與HPV16- raft單細胞測序分群展示

 

2. 角質形成細胞亞群主要由分層鱗狀上皮的分化程序來定義

研究者進行了擬時序分析發現，除了C9，其他所有角質形成細胞亞群都沿著鱗狀上皮分化程序連續排列。依據基因表達特征，細胞亞群也顯示出基底細胞（C10、C7、C6、C4 和 C5）或分化細胞特征（C1、C8、C0、C11、C2 和C3)。IHC 染色檢查 HPV16- 和 HPV16+  raft中特異性標記物的蛋白質表達顯示也與之前一致。然而，值得注意的是，HPV16+ 上皮細胞的分化標記物染色強度較低，表明 HPV 重編程抑制了正常的分化程序，特別是在上皮細胞的最上層。、
 

圖3 擬時序分析使細胞沿著三維分層上皮的分化程序排列

 

3. 基底上細胞簇的空間映射揭示了 HPV16+ raft中尚未描述的上皮區域

由于scRNA-seq不能識別空間位置信息，因此研究者使用 RNA-ISH來定位選定的角質形成細胞亞群。鑒于在基底上HPV+ vs HPV- raft中觀察到的差異蛋白染色，最上面的分化亞群特別令人感興趣。他們假設地理分布的差異可能反映了HPV 的轉錄重編程，并且也是圖 3f 中觀察到的蛋白質水平變化的基礎。為此，C3被確定為最終末分化的細胞亞群。

之后研究者依據自己的篩選標準試圖識別“聚類定義基因”，這些基因可以作為生物標志物，獨立地表示聚類。他們確定了用于C2（C10orf99 和 DSG1）和C3（KLK7、SPRR1A、RDH12 和 POF1B）兩個群中的基因。接下來，研究者發現終末分化的 C2 和 C3 角質形成細胞亞群在亞匯合單層培養物中基本上不存在，并且它們的形成需要上皮分化程序。RNA-ISH空間映射和C3生物標志物KLK7用于定位raft中的這種分化亞群。他們發現KLK7在 HPV+ 與 HPV- rafts 中的定位具有差異，表明HPV16+ rafts中基底上簇的失調。雖然KLK7+ C3細胞位于HPV16- rafts的最上層，但HPV16+ rafts在KLK7+細胞上方還有一個額外的區域（紅標記線，圖 4e）。
 

圖4 分層鱗狀上皮中終末分化的 KLK7+ C3 角質形成細胞亞群的空間定位

 

4. C9轉錄組定義了一個分化不協調的角質形成細胞亞群，該亞群形成了HPV16+raft的最上層

研究者識別并可視化了C9簇的生物標記物，包括ELF3、GPR110和Lcn2。相對于未分化（亞融合）細胞，C9 細胞標志物的表達在分化模型（過度融合細胞和raft）中增加。因此它仍然依賴于分化程序，研究者決定在復層上皮模型中進行研究。研究者用C9 簇標記物的 RNA-ISH 將這個群體定位到最上層的基底上區域，在 HPV16+ raft的許多細胞中具有強烈的染色。IF顯示ELF3 和 LCN2 蛋白定位于 HPV16+ rafts 的最上層區域，而在 HPV16- rafts 中基本不存在。之后研究者應用通路分析和轉錄因子分析顯示病毒發病機制和鱗狀細胞分化的重要性。為了捕捉 C9 轉錄組的這些特征，他們將 C9 亞群稱為 HPV 誘導的分化不協調上皮非常規 (HIDDEN) 細胞。

 

圖5 C9細胞占據HPV16+上皮的淺表細胞層

 

5. HPV+宮頸raft中HIDDEN細胞上調

研究者使用了由原代宮頸角質形成細胞設計的器官型上皮raft（感染了HPV18的HPV+和HPV-）。通過 RNA-ISH和 IF檢測到許多強烈染色的 ELF3+ 基底上細胞。這表明 (1) 在健康宮頸上皮細胞的基線觀察到很少的 ELF3+ 細胞，(2) HIDDEN 細胞在宮頸上皮細胞中被 HPV 高度上調，以及 (3) 其他高危 HPV 類型如 HPV18 也誘導 HIDDEN細胞區域。

 

6. 在HPV驅動的宮頸癌發生的各個階段都檢測到HIDDEN細胞

研究者試圖評估在宮頸上皮內瘤變(CIN)的不同階段。一般來說，CIN1病灶包含病毒片段，而CIN2和CIN3含有片段和整合的病毒基因組，存在異常增生并發展為宮頸鱗狀細胞癌（SCC）。研究者收集、處理和篩查疑似宮頸上皮內瘤變患者的宮頸活檢組織中的高危HPV標志物p16。隨后IF染色以尋找HIDDEN細胞生物標記物ELF3。結果顯示：ELF3蛋白在正常宮頸外上皮組織中低表達或檢測不到。但p16+基底細胞上方的組織顯示出ELF3的強烈染色。這包括具有 HPV 特征和 CIN 病變的組織，無論等級如何。在具有 CIN 病變的組織的某些區域中，觀察到 ELF3 染色在中間區域中更強烈，而在更淺表的細胞中染色強度較低（CIN1）。盡管如此，在所有 p16+ 組織中，HIDDEN 細胞都得到了極大的擴增。
 

圖6 在HPV陽性宮頸raft和宮頸癌前病變中檢測到HIDDEN細胞
 

7. HIDDEN細胞生物標志物在HPV+SCC腫瘤中升高

由于發現 HIDDEN 細胞持續存在于癌前宮頸組織 (CIN1-3) 的所有階段，研究者提出 HIDDEN 細胞從癌前病變進一步持續存在到惡性鱗狀細胞癌中。因此研究者分析了 PanCancer TCGA 以確定癌癥中HIDDEN細胞生物標志物的表達。在可供分析的 488 名 HNSCC 患者中，與其余患者相比，9% 的 ELF3 表達顯著升高 (z ≥ 2.0)。重要的是，該患者亞組在 HPV 狀態、國際疾病分類 (ICD)-10 分類（指示解剖位置）、染色體 1q 異常和缺氧評分方面具有統計學顯著差異。接下來研究者在HPV+ vs HPV- HNSCC 中探究了ELF3 的表達，也檢測了按 ICD-10 分組的 HNSCC 中的 ELF3 mRNA 的水平。以上結果支持在 HPV+ 疾病過程（包括癌癥）中存在 ELF3 驅動的分化鱗狀細胞亞群。

隨后研究者使用TCGA 數據集中的大型 HNSCC 和宮頸 SCC 患者隊列改進 HIDDEN 細胞轉錄組，以識別強有力的共生生物標志物，用于檢測 SCC 中的類似群體。
 

圖7 ELF3 依賴性 C9 細胞群與 HPV+ 頭頸和宮頸 SCC 相關

 

8. 在已發表的 HNSCC scRNAseq 數據中檢測到 HPV+HIDDEN 細胞特征

為了在獨立數據集中驗證上述特征，研究者分析了9個 HPV- 和6個 HPV+HNSCC 腫瘤的已發表 scRNAseq 數據，并證實了 HIDDEN 細胞的存在且在HPV+中增加。
 

圖8 在HPV+和HPV - HNSCC scRNAseq數據中檢測到HIDDEN細胞

 

9. HIDDEN細胞在HPV+扁桃體raft和HPV+HNSCC患者活檢組織中富集

研究者檢查了HPV 感染和轉化的頭頸部組織中HIDDEN細胞是否存在。初級扁桃體上皮被用作口咽部 HPV 感染的模型。研究者通過檢測HPV+和HPV -raft中 ELF3 和 GPR110發現 HPV+中HIDDEN 細胞顯著上調。研究者也對 HNSCC 患者活組織進行了同樣檢查并具有同樣發現。
 

圖9 在 HPV+ 扁桃體衍生的上皮細胞和 HNSCC 患者活檢組織中檢測到HIDDEN細胞

 

10. ELF3 敲低抑制HPV16+上皮raft中的HIDDEN細胞

研究者在 HPV16+ NIKS 中敲低ELF3并用于生成raft。結果顯示，ELF3 敲低幾乎完全消除了 HPV+ raft最上層區域中的 ELF3+ HIDDEN 細胞，且HIDDEN 上皮亞群中與 ELF3 共表達的基因表達減少。這些數據表明，ELF3轉錄因子是分層 HPV16 感染上皮中基底上層HIDDEN細胞區室的形成和/或維持所必需的。
 

圖10 HIDDEN 細胞區需要 ELF3 表達

 

主要結論

1. 報告了高危 HPV 感染的分層上皮細胞的轉錄組學景觀；

2. 發現了形成隔室并有可能標記 HPV 感染組織表面的上皮HIDDEN細胞；

3. 鑒定了 ELF3作為 HIDDEN 區域所需的 HPV 誘導轉錄驅動因子；

4. 檢測 HPV+ SCC 中的 HIDDEN 細胞富集并與預后不良相關聯。