DLin-DMA在siRNA遞送的陽離子脂質設計及用于肝臟基因沉默上的應用
DLin系列
試驗一：KC2用于siRNA遞送的陽離子脂質的合理設計[1]
本實驗中，研究人員采用了一種合理的方法來設計陽離子脂質，并制備用于遞送小干擾RNA（siRNA）的配方。以穩定核酸脂質顆粒（SNALP）的關鍵脂質成分1，2-二甲醇氧基-3-二甲基氨基丙烷（DLinDMA）為例，研究人員利用所提出的可電離陽離子脂質的體內作用機制來指導設計具有優異遞送能力的基于DLinDMA結構拓展的脂質。通過篩選后，對性能最好的脂質（DLin-KC2-DMA），進行了SNALP配制和表征，并在嚙齒類動物和非人靈長類動物中分別在低至0.01 mg/kg和0.1 mg/kg的siRNA劑量下，證明具有體內活性。研究發現，DLin-KC2-DMA介導的基因沉默比以前關于體內內源性肝臟基因沉默的報道有了實質性的改進。
圖1.1. 新型陽離子脂質的體內評價
鑒于正電荷在指導脂質設計的作用機制假說中的重要性，在DLin-K-DMA作為新的基準脂質的綜述中研究了胺基頭基結構變化的影響。進行了一系列頭基修飾、表征和測試，以探索大小、酸離解常數和可電離基團數量的影響（補充合成2和補充表2）。所測試的哌嗪基、嗎啉基、三甲基氨基或雙二甲基氨基修飾并不優于DLin-K-DMA的基準二甲基氨基頭基。作為附加參數，通過引入額外的亞甲基來改變二甲基氨基和二氧戊環連接體之間的距離。該距離可以影響胺頭基的pKa以及電荷呈現相對于脂質雙層界面的距離和柔性。相對于DLin-K-DMA，將單個額外的亞甲基插入頭部基團（DLin-KC2-DMA）產生效力的顯著增加。在FVII模型中，這種脂質的ED50約為0.1 mg/kg，使其效力比DLin-K-DMA高4倍，比DLinDMA基準高10倍。然而，具有額外亞甲基的系鏈的進一步延伸顯著降低了活性，DLin-KC3-DMA的ED50約為0.6 mg/kg，DLin-KC4-DMA的ED50>3 mg/kg。
總結，研究人員將一種合理的方法應用于新型陽離子脂質的設計，這些脂質被篩選用于基于LNP的siRNA遞送系統。脂質結構分為三個主要功能元件：烷基鏈、連接基和頭基。以DLinDMA為起點，通過保持其他兩個元素不變，以系統的方式研究了這些元素中每一個的影響。首先，建立了烷基鏈，然后改變了連接體，最后，探索了不同的頭基結構。使用這種方法，描述了可離子化陽離子脂質的重要結構-活性考慮因素，并鑒定了相對于DLinDMA基準具有改進活性的脂質。性能最好的脂質（DLin-KC2-DMA）的SNALP制劑在嚙齒類和非人類靈長類動物中都具有良好的耐受性，并且在嚙齒類動物中在低至0.01mg/kg的siRNA劑量下表現出體內活性，并且在非人類靈長目動物中表現出治療顯著基因（TTR）的沉默。盡管目前的工作范圍僅限于體內肝臟遞送，但與之前關于LNP siRNA介導的非人靈長類動物沉默的報道相比，這項工作中實現的TTR沉默（ED50～0.3 mg/kg）代表了活性的顯著提高。
試驗二：MC3最大限度地提高siRNA脂質納米顆粒在體內用于肝臟基因沉默的效力[2]
pKa的考察
如圖2所示，四種可電離陽離子脂質的pKa的測定實例。pKa的取值，定義為在一半最大熒光強度下的pH值。(A). 14，pKa=4.17；(B). 52，pKa=5.73；(C). 19，pKa=6.95；(D). 48，pKa=8.12。
2.3. 小鼠肝臟基因沉默活性圖
可電離陽離子脂質15、16和17的混合物使所得LNP的平均表面pKa值在5.64和6.93之間遞增移位。括號中的數字表示混合物中陽離子脂質的摩爾比（氨基脂質組分）。
圖1. DLin-KC2-DMA為例的結構設計
試驗一：KC2用于siRNA遞送的陽離子脂質的合理設計[1]
本實驗中，研究人員采用了一種合理的方法來設計陽離子脂質，并制備用于遞送小干擾RNA（siRNA）的配方。以穩定核酸脂質顆粒（SNALP）的關鍵脂質成分1，2-二甲醇氧基-3-二甲基氨基丙烷（DLinDMA）為例，研究人員利用所提出的可電離陽離子脂質的體內作用機制來指導設計具有優異遞送能力的基于DLinDMA結構拓展的脂質。通過篩選后，對性能最好的脂質（DLin-KC2-DMA），進行了SNALP配制和表征，并在嚙齒類動物和非人靈長類動物中分別在低至0.01 mg/kg和0.1 mg/kg的siRNA劑量下，證明具有體內活性。研究發現，DLin-KC2-DMA介導的基因沉默比以前關于體內內源性肝臟基因沉默的報道有了實質性的改進。
表1.1 基于DLin-DMA的結構設計
圖1.1. 新型陽離子脂質的體內評價（a）. DLinDAP的沉默活性(▼), DLinDMA(▲), DLin-K-DMA(■) 和DLin KC2-DMA（●）在小鼠FVII模型中的篩選。所有LNP siRNA系統都是使用預成型囊泡（PFV）方法制備的，由可電離的陽離子脂質、DSPC、膽固醇和PEG脂質（40:10:40:10mol/mol）組成，FVII siRNA/總脂質的比例約為0.05（wt/wt）。
（b）. 頭群擴展對DLin-K-DMA活性的影響。DLin-K-DMA（■）在DMA頭基和縮酮環連接體之間添加了額外的亞甲基，以生成DLin-KC2-DMA（●），DLin-KC3-DMA（▲）和DLin-KC4-DMA（▼）在小鼠因子VII模型中評估每種脂質的制劑活性。
（b）. 頭群擴展對DLin-K-DMA活性的影響。DLin-K-DMA（■）在DMA頭基和縮酮環連接體之間添加了額外的亞甲基，以生成DLin-KC2-DMA（●），DLin-KC3-DMA（▲）和DLin-KC4-DMA（▼）在小鼠因子VII模型中評估每種脂質的制劑活性。
表1.2 含有新型脂質的LNPs的生物物理參數和體內活性
鑒于正電荷在指導脂質設計的作用機制假說中的重要性，在DLin-K-DMA作為新的基準脂質的綜述中研究了胺基頭基結構變化的影響。進行了一系列頭基修飾、表征和測試，以探索大小、酸離解常數和可電離基團數量的影響（補充合成2和補充表2）。所測試的哌嗪基、嗎啉基、三甲基氨基或雙二甲基氨基修飾并不優于DLin-K-DMA的基準二甲基氨基頭基。作為附加參數，通過引入額外的亞甲基來改變二甲基氨基和二氧戊環連接體之間的距離。該距離可以影響胺頭基的pKa以及電荷呈現相對于脂質雙層界面的距離和柔性。相對于DLin-K-DMA，將單個額外的亞甲基插入頭部基團（DLin-KC2-DMA）產生效力的顯著增加。在FVII模型中，這種脂質的ED50約為0.1 mg/kg，使其效力比DLin-K-DMA高4倍，比DLinDMA基準高10倍。然而，具有額外亞甲基的系鏈的進一步延伸顯著降低了活性，DLin-KC3-DMA的ED50約為0.6 mg/kg，DLin-KC4-DMA的ED50>3 mg/kg。
圖1.2. 基于DLin-K-DMA，延長頭部基團碳鏈長度對粒徑及ED50的影響
圖1.3. KC2-SNALP對嚙齒類動物和非人類靈長類動物的療效
圖1.3. KC2-SNALP對嚙齒類動物和非人類靈長類動物的療效（a） 相對于在小鼠中測試的初始篩選制劑，KC2-SNALP的療效得到改善。KC2-SNALP的體內療效(○) 與小鼠因子VII模型中未優化的DLin-KC2-DMA篩選（即PFV）制劑（●）的結果進行比較。數據點以PBS對照動物的百分比表示，代表組平均值（n=5）±s.d.（b）KC2-SNALP在非人靈長類動物中的療效。食蟹猴（每組n=3）接受0.03、0.1、0.3或1 mg/kg siTTR，或1 mg/kg在KC2-SNALP或PBS中配制的siApoB的總劑量，通過頭靜脈靜脈輸注15分鐘（5 ml/kg）。給藥后48小時對動物實施安樂死。在肝臟樣品中測定TTR mRNA水平相對于GAPDH mRNA水平。數據點代表組平均值±s.d.*，P<0.05；**，P＜0.005。
表1.3 含有KC2的SNALP的體內活性
總結，研究人員將一種合理的方法應用于新型陽離子脂質的設計，這些脂質被篩選用于基于LNP的siRNA遞送系統。脂質結構分為三個主要功能元件：烷基鏈、連接基和頭基。以DLinDMA為起點，通過保持其他兩個元素不變，以系統的方式研究了這些元素中每一個的影響。首先，建立了烷基鏈，然后改變了連接體，最后，探索了不同的頭基結構。使用這種方法，描述了可離子化陽離子脂質的重要結構-活性考慮因素，并鑒定了相對于DLinDMA基準具有改進活性的脂質。性能最好的脂質（DLin-KC2-DMA）的SNALP制劑在嚙齒類和非人類靈長類動物中都具有良好的耐受性，并且在嚙齒類動物中在低至0.01mg/kg的siRNA劑量下表現出體內活性，并且在非人類靈長目動物中表現出治療顯著基因（TTR）的沉默。盡管目前的工作范圍僅限于體內肝臟遞送，但與之前關于LNP siRNA介導的非人靈長類動物沉默的報道相比，這項工作中實現的TTR沉默（ED50～0.3 mg/kg）代表了活性的顯著提高。
試驗二：MC3最大限度地提高siRNA脂質納米顆粒在體內用于肝臟基因沉默的效力[2]
pKa的考察
圖2.1.TNS熒光法測定pKa
如圖2所示，四種可電離陽離子脂質的pKa的測定實例。pKa的取值，定義為在一半最大熒光強度下的pH值。(A). 14，pKa=4.17；(B). 52，pKa=5.73；(C). 19，pKa=6.95；(D). 48，pKa=8.12。
圖2.2. 小鼠體內肝臟基因沉默活性與pKa的關系圖。
將56個可電離陽離子脂質配制成LNP，并進行ED50分析，根據它們的pKa，繪制得到圖4。有15種脂質，沒有達到ED50劑量。剩余的脂質，通過最佳擬合曲線突出顯示了最具活性的化合物，其表現出在6.2和6.5之間的最佳pKa。
表2.1. 56種可電離陽離子脂質的設計及其ED50，pKa值考察
2.3. 小鼠肝臟基因沉默活性圖
pKa在4-8.5之間，計算質子化/未質子化可電離陽離子脂質的電離程度（%摩爾分數）。每個FVII ED50數據點（藍色）來源于四劑量反應（每個劑量水平n=4只小鼠）。假設pH為7.4，在血液中攜帶正電荷的陽離子脂質顯示為紅色，而在pH為5.5的酸性內涵體中不帶電的陽離子脂質的顯示為綠色
圖2.4.支持pKa值作為決定可電離陽離子脂質，體內肝臟基因沉默活性的主導因素。
可電離陽離子脂質15、16和17的混合物使所得LNP的平均表面pKa值在5.64和6.93之間遞增移位。括號中的數字表示混合物中陽離子脂質的摩爾比（氨基脂質組分）。
圖2.5.可電離陽離子脂質（16，DLin-MC3-DMA）的siRNA-LNP在小鼠和非人類靈長類動物中的功效。
在本研究中使用了含有50摩爾%的16（DLin-MC3-DMA）的經過優化后的制劑組合。相對于具有約0.005 mg.kg-1的中值有效siRNA劑量（ED50）的生理鹽水對照組，小鼠血清中的殘余FVII活性；柱狀圖代表平均值（n＝5）給予食蟹猴0.03、0.1和0.3mg.kg-1劑量的靶向TTR基因的siRNA。線型圖則表示平均值（n=3），以TTR mRNA表示，相對于肝臟樣本中測定的GAPDH mRNA水平，ED50估計為<0.03 mg.kg-1。
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