實驗原理：

腫瘤血管生成是一個極其復雜的過程，一般包括包括血管內皮基質降解、內皮細胞移行、內皮細胞增殖、內皮細胞管道化分支形成血管環(huán)和形成新的基底膜等步驟。

無論原發(fā)性腫瘤還是繼發(fā)性腫瘤，一旦生長直徑超過1~2 mm，都會有血管生成。這是由于腫瘤細胞自身可分泌多種生長因子，誘導血管生成。多數(shù)惡性腫瘤的血管生成密集且生長迅速。因此，血管生成在腫瘤的發(fā)展轉移過程中起到重要作用，抑制這一過程將能明顯阻止腫瘤組織的發(fā)展和擴散轉移。

體外的血管生成實驗能很好的模擬腫瘤的血管發(fā)生過程，并且適合研究藥物對這一過程的影響實驗。我們以HUVEC細胞為例，介紹這一實驗的詳細過程。

血管生成鏡檢圖

實驗材料和實驗方法：

試劑和緩沖液

人臍靜脈內皮細胞（HUVEC，C-12203，PromoCell）
• IV膠原蛋白（354233，康寧）
• 0.05 M HCl （X942.1， Carl Roth）
• 內皮細胞生長培養(yǎng)基（促進細胞，C-22010）
• PBS （14190144， Gibco）
• Accutase （A1110501， Gibco）
• 基質膠®生長因子降低，無酚紅（康寧® #356231），每孔10μl
•可選：鈣黃綠素AM（促銷因子，PK-CA707-80011）
設備

• µ-Slide 15 Well 3D，ibiTreat （81506，ibidi）

• 載玻片架（80003，ibidi）

• 用于檢查最佳凝膠體積的刻度紙

• 冰和冷卻架

• 標準細胞培養(yǎng)設備（移液器、無菌工作臺、細胞培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、血細胞計數(shù)器等）

• 可選：多通道移液器

• 倒置顯微鏡（可選配熒光和適當?shù)拟}黃綠素濾光片組染色）

實驗方法：

實驗流程介紹

血管生成實驗流程
 

（提前將Matrigel融化，鋪于ibidi血管生成載玻片的下孔中，待膠凝后，將細胞懸液加入血管生成載玻片上孔中，成管后使用顯微鏡觀察。）

實驗步驟

1.準備基質膠

1）.實驗前一天將Matrigel置于冰盒中，放入4℃冰箱，使膠能過夜緩慢融化。（注意：同樣要準備一些4℃預冷的槍頭用于吸取Matrigel）

2）.開始實驗前，將Matrigel始終保持放在冰盒中。

3）.打開滅菌包裝，取出ibidi血管生成載玻片。

4）.每孔中加入10μl Matrigel。注意槍頭要垂直于內孔的正上方加入Matrigel，防止有Matrigel流經上孔而留下殘留膠。

由于Matrigel流動性不強，并且有可能移液槍不準確，有可能打入10μl的膠，卻不能填滿血管生成載玻片的下孔——這樣，必然會影響到實驗的成像結果。

如何判斷是否加入了合適體積的Matrigel：

我們只需用一張格子紙就能知道自己的移液槍調整到多少能正好把下孔填滿。

 

如上圖所示，垂直透過每個孔看下面的格子紙，如果格子被縮小了，那么就說明膠沒加滿，格子被放大了，那么膠就加多了，格子沒發(fā)生什么變形，這才是剛剛加滿下孔的狀態(tài)。

 

2.凝膠

 

1）.蓋上ibidi血管生成載玻片的蓋子。

2）.準備一個10cm的培養(yǎng)皿，放入浸過水的紙巾，制成一個濕盒。

3）.將ibidi血管生成載玻片放入培養(yǎng)皿中，蓋上培養(yǎng)皿蓋。

4）.將整個培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中，靜置30分鐘左右，等待膠凝結。

5）.等待同時準備細胞懸液。

 

 

3.鋪細胞

 

加入細胞的量直接影響實驗結果，所以在正式實驗開始之前，要對不同類型的細胞和使用數(shù)量進行預實驗。獲得最佳比例的細胞密度。我們今天的實驗使用HUVEC細胞，每孔種10000個細胞即可。
1）.準備密度為2*105cells/ml的細胞懸液，充分混勻。

2）.將膠已經凝固的ibidi血管生成載玻片從濕盒中取出。
3）.每孔加入50μl的細胞懸液，注意保持槍頭垂直在上孔的上方，不要接觸下孔的凝膠。可以使用排槍。
4）.同樣用格子紙查看是不是加了足夠量的液體，如果沒有，加入無細胞的培養(yǎng)基，使上孔液體正好加滿。
5）.蓋上蓋，靜置，一段時間后，所有細胞都會沉下去落在Matrigel的表面。

 

 

4.采集圖像并統(tǒng)計結果

 

可以按照細胞的生長速度定時采集圖像，并且對其成管長度，覆蓋面積，成環(huán)數(shù)，結點數(shù)進行測量和記錄，并且對其進行統(tǒng)計分析。

 

5.免疫熒光染色

根據(jù)需要，可以對成管結果進行免疫熒光染色。
1）.小心的移除上孔內培養(yǎng)基，注意不要碰到膠或者細胞網絡。
2）.加入50μl用無血清培養(yǎng)基稀釋的calcein (12.5 µl calcein stock 1 µg/µl)，使其終濃度為 6.25 µg/ml (1:160)。
3）.在室溫下避光孵育30分鐘。
4）.使用PBS清洗三次，注意，PBS要緩緩加入上孔，以免沖擊掉細胞。
5）.使用 485 nm/ 529 nm進行免疫熒光成像。

實驗優(yōu)勢:

1.此實驗方法能節(jié)省更多基質膠，降低實驗成本。

2.分上下孔的ibidi血管生成載玻片能去除凹液面，使成像效果更好。

 

（左側ibidi血管生成載玻片無凹液面，整個視野成像清晰；右側96孔板有凹液面，中間清晰周圍模糊。）

 

 

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