空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

常見Q&A合集

Part.01 樣品

Q1：空間轉(zhuǎn)錄組適用的樣品類型？

新鮮樣本可以適用于多個(gè)物種，包括：人類、小鼠、大鼠、斑馬魚；FFPE樣本僅適用于人類和小鼠。

目前10x Genomics官方推薦的樣本物種包括：

新鮮樣本包括：人類（大腦、脊髓、心臟、乳房、乳腺、肺、淋巴結(jié)、腎臟、大腸-結(jié)直腸癌、卵巢、脾臟等）、鼠（大腦、眼睛、心臟、脊髓、股四頭肌、眼睛、肺、甲狀腺、肝臟、脾臟、胃、腎臟、大腸、小腸、睪丸、卵巢、嗅球、肱四頭肌、舌頭等）；  

FFPE樣本包括：人類（大腦、胸部、宮頸、心臟、脊柱、脊髓、肺、淋巴結(jié)、脾、前列腺、皮膚、腸、子宮等），小鼠（大腦、心臟、肝、脾、腎、睪丸、胸腺、胚胎、肌肉、子宮、胎盤、小腸、舌頭以及皮膚等）。

若樣本不在測(cè)試行列內(nèi)，則需要進(jìn)行評(píng)估。

對(duì)于FFPE樣本，常規(guī)Visium只接收石蠟塊組織樣本；新推出的CytAssist產(chǎn)品可以兼容石蠟塊、白片、預(yù)貼片或預(yù)染色的石蠟切片（10x標(biāo)準(zhǔn)中推薦的載玻片貼片）以及組織芯片（TMA）等多種樣本類型。

Q2：確定做空間轉(zhuǎn)錄組的樣本應(yīng)該怎么處理？

（1）對(duì)于新鮮組織，處理和保存方法如下：

先冷凍后包埋法：新鮮組織樣本取下后要迅速用預(yù)冷的鑷子將新鮮組織浸沒(méi)在異戊烷至組織完全冷凍，然后進(jìn)行OCT包埋（盡量保持15min內(nèi)）。若無(wú)異戊烷，也可直接進(jìn)行OCT包埋。公司官網(wǎng)（https://www.shbiochip.com/）提供詳細(xì)的OCT包埋教學(xué)視頻，同時(shí)也提供不同型號(hào)的包埋盒，可根據(jù)需要進(jìn)行選擇。

🔸 樣本能否直接液氮凍存？

不可以液氮直接速凍，直接液氮處理可能在沸騰過(guò)程中使組織周圍形成空穴，導(dǎo)致不同區(qū)域降溫不同步而改變內(nèi)部形態(tài)，甚至組織碎裂。

🔸 若組織表面有血跡能否進(jìn)行沖洗？

用預(yù)冷的PBS溶液或生理鹽水進(jìn)行沖洗，但沖洗后需要用干凈的吸水紙吸干液體，防止形成冰晶，影響包埋。

（2）對(duì)于FFPE樣本，處理及運(yùn)輸要求如下：

🔸 常規(guī)Visium ：

4℃密封保存運(yùn)輸石蠟塊樣本（建議用包埋盒送樣，防止運(yùn)輸過(guò)程中樣本損壞）。

🔸 CytAssist：

CytAssist不同類型FFPE樣本送樣要求

10x Genomics官方推薦的品牌玻片有效區(qū)域示意圖

🔸 若石蠟切片單個(gè)樣本切少于或超過(guò)5μm厚度，還能做空間轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)嗎？

5μm是10x官方測(cè)試時(shí)采用并推薦的厚度，若實(shí)際組織超過(guò)或小于5μm，評(píng)估合格后也可做空間轉(zhuǎn)錄組，但可能會(huì)影響最終數(shù)據(jù)結(jié)果。

🔸 FFPE樣本想要做空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，最多保存多久？

推薦是保存在一年之內(nèi)的樣本，若超過(guò)一年，可以先取少量樣本進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，若質(zhì)檢合格，也可進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)。因組織類型、時(shí)間和存放條件的不同，RNA的降解速度也會(huì)存在差異，因此僅依靠存放年限無(wú)法準(zhǔn)確判斷石蠟包埋塊是否可用。目前是主要根據(jù)包埋塊切片RNA的 DV200>50%（最新CytAssist要求DV200>30%）指標(biāo)來(lái)確定（不論樣本保存時(shí)間是否超過(guò)一年，都需要先進(jìn)行質(zhì)檢）。

🔸 樣本規(guī)格要求，是否超過(guò)6.5*6.5mm即無(wú)法做空間轉(zhuǎn)錄組？

根據(jù)芯片規(guī)格推薦樣本大小在6.5*6.5mm之內(nèi)，但是如果組織樣本過(guò)大，對(duì)于新鮮樣本現(xiàn)階段可以提供兩種解決方案：1）選取整個(gè)組織中感興趣的區(qū)域（小于6.5*6.5mm），實(shí)驗(yàn)人員評(píng)估修片可行性，然后決定是否進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；2）若整個(gè)組織都為目標(biāo)區(qū)域，則將組織分為兩份，分別貼片到兩個(gè)點(diǎn)陣進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

常規(guī)Visium芯片規(guī)格

此外，10x 公司新推出的CytAssist，提供了兩種芯片規(guī)格可供選擇，分別為6.5*6.5mm和11*11mm，較大組織也可實(shí)現(xiàn)一次性檢測(cè)，現(xiàn)在已經(jīng)可用于FFPE樣本實(shí)驗(yàn)，并且后續(xù)升級(jí)后也可應(yīng)用于新鮮樣本。

CytAssist芯片規(guī)格

新鮮/FFPE樣本質(zhì)檢要求

Part.02 常規(guī)Visium 與CytAssist相比做了哪些更新？

Q1: 實(shí)驗(yàn)流程

🔸 常規(guī)Visium實(shí)驗(yàn)流程：

樣本貼片于Visium芯片 ➡  脫蠟、HE染色、成像➡  探針雜交 ➡  建庫(kù)和測(cè)序

🔸 CytAssist實(shí)驗(yàn)流程：

FFPE組織切片后貼于標(biāo)準(zhǔn)載玻片  ➡  脫蠟、染色、成像、解交聯(lián)、探針雜交 ➡  CytAssist儀器中完成分析物轉(zhuǎn)移 ➡  建庫(kù)和測(cè)序

🔸 流程更新：

常規(guī)Visium的脫蠟、HE染色、成像以及探針雜交等步驟在Visium空間芯片上進(jìn)行；CytAssist的脫蠟、染色、成像、解交聯(lián)和探針雜交等步驟在標(biāo)準(zhǔn)載玻片進(jìn)行，隨后在Visium CytAssist儀器中進(jìn)行明場(chǎng)成像以及完成分析物轉(zhuǎn)移，無(wú)需進(jìn)行多次切片貼片及粘附性測(cè)試實(shí)驗(yàn)，極大的簡(jiǎn)化了樣本的處理。

常規(guī)Visium vs CytAssist實(shí)驗(yàn)流程對(duì)比

Q2: 其他

常規(guī)Visium vs CytAssist

Part.03 單細(xì)胞+空間聯(lián)合分析

Q1: 空間轉(zhuǎn)錄組是單細(xì)胞分辨率的嗎？

空間轉(zhuǎn)錄組的檢測(cè)不是單細(xì)胞層面的，Visium芯片一個(gè)玻片上每個(gè)捕獲區(qū)域面積為6.5mm*6.5mm（CytAssist提供了6.5mm*6.5mm和11mm*11mm兩個(gè)規(guī)格芯片），每個(gè)點(diǎn)陣內(nèi)有約5000個(gè)spot，根據(jù)樣本類型不同，每個(gè)spot內(nèi)的細(xì)胞數(shù)約1-10個(gè)細(xì)胞。Q2: 為什么要做空間轉(zhuǎn)錄組？

組織中除了細(xì)胞異質(zhì)性，其空間分布對(duì)于疾病的發(fā)生發(fā)展也有重要的意義。單細(xì)胞測(cè)序能夠鑒定組織中的細(xì)胞類型，但有時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)對(duì)照組和處理組的細(xì)胞類型相似。以腫瘤為例，通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序，可能在對(duì)照組和處理組都發(fā)現(xiàn)了相同的免疫細(xì)胞類型，而免疫細(xì)胞浸潤(rùn)對(duì)疾病的發(fā)展和預(yù)后具有明顯的影響。因此，如果僅僅靠單細(xì)胞一個(gè)層面的數(shù)據(jù)，有時(shí)是很難解釋清楚，此時(shí)細(xì)胞類型在組織的空間分布對(duì)于數(shù)據(jù)分析就顯得尤為重要。通過(guò)結(jié)合空間轉(zhuǎn)錄組能夠?qū)⒉煌��?xì)胞類型表達(dá)的marker基因映射到空間上，從而比較不同組織類型間細(xì)胞類型的空間分布特征。單細(xì)胞聯(lián)合空間轉(zhuǎn)錄組分析不僅可以提高細(xì)胞類型注釋的可靠性，還可以精確全面地揭示表達(dá)譜信息，特定細(xì)胞類型及其特定空間位置、特定生物學(xué)過(guò)程中的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程、細(xì)胞和細(xì)胞之間的通訊聯(lián)系（在空間上是否真實(shí)分布在臨近區(qū)域）。

此外，傳統(tǒng)的FISH和IF雖然可以觀察到病理組織的空間信息，但屬于中低通量的檢測(cè)，多用于篩選后的結(jié)果驗(yàn)證。

Q3: 如何跟單細(xì)胞聯(lián)合分析？

（1）通過(guò)單細(xì)胞細(xì)胞類型鑒定結(jié)果輔助判定細(xì)胞的空間分布

通過(guò)分析單細(xì)胞數(shù)據(jù)，確定于疾病密切相關(guān)的細(xì)胞群，然后通過(guò)將單細(xì)胞注釋到的細(xì)胞群marker基因圖譜與空間數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，確定不同細(xì)胞類型的空間分布，為了解細(xì)胞類型的特定空間位置分布提供依據(jù)。

（2）對(duì)比不同分組間的空間結(jié)果，深入挖掘單細(xì)胞數(shù)據(jù)

🔸 分析不同細(xì)胞類型如何分布（在疾病區(qū)域、鄰區(qū)或正常區(qū)域），確定空間結(jié)構(gòu)是否具有明確區(qū)域劃分；

🔸 通過(guò)分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，不同區(qū)域之間是否有特異性的差異基因；

🔸 不同區(qū)域的細(xì)胞之間是否存在細(xì)胞互作關(guān)系，并聯(lián)合特異性的差異基因功能分析，探討細(xì)胞互作涉及的分子機(jī)制及通路，尋找疾病發(fā)病機(jī)制及治療靶點(diǎn)。

Q4: 空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序一起進(jìn)行聯(lián)合分析，是否每個(gè)空轉(zhuǎn)的樣本都需要搭配相同樣本的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組？

如果空轉(zhuǎn)的樣本來(lái)自不同的患者，推薦每個(gè)患者各做一個(gè)單細(xì)胞測(cè)序。如果有幾個(gè)空轉(zhuǎn)的樣本來(lái)自一個(gè)患者的同一個(gè)組織，可以這幾個(gè)樣本做一個(gè)單細(xì)胞，具體還需要根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)決定樣本量，但是有一個(gè)基本前提：?jiǎn)渭?xì)胞和空間樣本在病理上出現(xiàn)的細(xì)胞類型是重合的。