今天小編帶來一篇發(fā)表在Nature上的膠質(zhì)瘤相關(guān)的文章解讀。該文章利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)找到了一群獨(dú)特的腫瘤細(xì)胞亞群，并利用GeoMx DSP空間轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)技術(shù)確認(rèn)了這群特殊腫瘤細(xì)胞在大腦組織中的空間位置分布。在這篇文章中，我們可以看到研究者是如何發(fā)揮單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，并將兩種不同技術(shù)的結(jié)果巧妙地串聯(lián)在一起，從而解析神經(jīng)元活動(dòng)促進(jìn)膠質(zhì)瘤進(jìn)展的分子機(jī)制。

文章詳情

文章題目：Remote neuronal activity drives glioma progression through SEMA4F

中文題目：遠(yuǎn)端神經(jīng)元活動(dòng)通過SEMA4F驅(qū)動(dòng)神經(jīng)膠質(zhì)瘤進(jìn)展

發(fā)表時(shí)間：2023.07

期刊名稱：Nature

影響因子：69.504

實(shí)驗(yàn)平臺(tái)：10x Genomics 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序+GeoMx DSP空間轉(zhuǎn)錄組等技術(shù)

DOI：10.1038/s41586-023-06267-2

01 研究背景

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）是最具有侵襲性和致命的腦腫瘤，增殖率和對(duì)周圍腦組織的浸潤率高，易復(fù)發(fā)。GBM浸潤通常沿著血管和白質(zhì)束，這些組織中包含神經(jīng)元軸突，暗示了神經(jīng)元可能參與腫瘤的浸潤。前人的研究已發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元活動(dòng)可以促進(jìn)腫瘤浸潤和發(fā)展，但是神經(jīng)元活動(dòng)是否通過旁分泌信號(hào)促進(jìn)GBM以及驅(qū)動(dòng)GBM浸潤的潛在分子機(jī)制尚不清楚，并且大腦中含有大量神經(jīng)元亞型，哪些亞型可驅(qū)動(dòng)GBM進(jìn)展也有待探究。

02 技術(shù)路線

為了解決上述問題，本研究主要使用的研究方法和分析思路如下：

1.構(gòu)建GBM小鼠模型，刺激原發(fā)癌對(duì)側(cè)神經(jīng)元激活，并利用熒光監(jiān)測(cè)腫瘤的浸潤情況，從而確認(rèn)對(duì)側(cè)神經(jīng)元活動(dòng)是否能夠影響腫瘤的浸潤和進(jìn)展。同時(shí)，結(jié)合數(shù)學(xué)模型和體外實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)對(duì)側(cè)神經(jīng)元的旁分泌因子與腫瘤浸潤的關(guān)系。

2.通過切斷胼胝體，或者選擇性激活對(duì)側(cè)腦神經(jīng)元，以確認(rèn)可能影響GBM浸潤和進(jìn)展的神經(jīng)元亞型。

3.利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，確認(rèn)GBM組織中腫瘤細(xì)胞在對(duì)側(cè)神經(jīng)元活動(dòng)的刺激下發(fā)生了怎樣的變化，并使用DSP空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，確認(rèn)這種變化的空間位置。

4.利用barcode screen技術(shù)篩選與GBM進(jìn)展和浸潤相關(guān)的候選基因，并通過生存分析、過表達(dá)和敲除實(shí)驗(yàn)確認(rèn)候選基因功能，從而鑒定到目的基因。

5.對(duì)目的基因過表達(dá)的腫瘤組織進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，以確認(rèn)該基因是否能產(chǎn)生與對(duì)側(cè)神經(jīng)元活動(dòng)刺激后相同的腫瘤細(xì)胞變化。隨后，利用富集分析確認(rèn)目的基因過表達(dá)后腫瘤細(xì)胞富集的信號(hào)通路。由于富集到的信號(hào)通路和目的基因家族都與突觸形成相關(guān)，因此研究者使用腦電圖檢測(cè)確認(rèn)突觸重塑的方向。

03 研究結(jié)果

1. 遠(yuǎn)端神經(jīng)元活動(dòng)可驅(qū)動(dòng)GBM進(jìn)展

刺激GBM小鼠原發(fā)區(qū)域?qū)��?cè)的神經(jīng)元活動(dòng)后發(fā)現(xiàn)，刺激組的總生存期（OS）中位值與對(duì)照組相比顯著減少、Ki67上調(diào)表達(dá)，并出現(xiàn)了高級(jí)別腫瘤的典型病理特征。這些結(jié)果表明對(duì)側(cè)神經(jīng)元活動(dòng)的刺激可促進(jìn)低級(jí)別腫瘤向高級(jí)別腫瘤方向發(fā)展。隨后，使用基于CRISPR-Cas9的子宮內(nèi)電穿孔（IUE）模型進(jìn)行研究。該模型中，GBM始發(fā)于單側(cè)大腦皮層，然后滲透穿過胼胝體到達(dá)對(duì)側(cè)半球。研究結(jié)果表明，對(duì)側(cè)神經(jīng)元活動(dòng)刺激可加速腫瘤的浸潤，上調(diào)Ki67的表達(dá)，而刺激同側(cè)神經(jīng)元雖然可以增加腫瘤增殖，但腫瘤浸潤無顯著變化。最后，通過數(shù)學(xué)建模分析，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，刺激組的腫瘤浸潤寬度相比于腫瘤質(zhì)量增加。體外實(shí)驗(yàn)則證實(shí)，用含有患者自發(fā)激活神經(jīng)元的皮層樣品制備的培養(yǎng)基處理GBM球后促進(jìn)了GBM的浸潤。綜上所述，這些結(jié)果表明神經(jīng)元活動(dòng)可通過分泌因子促進(jìn)腫瘤的浸潤，而原發(fā)癌對(duì)側(cè)的神經(jīng)元在進(jìn)展的早期階段可促進(jìn)這一現(xiàn)象。

Fig.1 遠(yuǎn)程神經(jīng)元刺激加速膠質(zhì)瘤進(jìn)展

2. CPNs促進(jìn)GBM的進(jìn)展

因?yàn)殡蓦阵w投射神經(jīng)元（CPNs）的軸突可沿著胼胝體橫跨皮層半球，因此研究者猜測(cè)是CPNs促進(jìn)腫瘤浸潤。為了驗(yàn)證這一猜想，研究者首先切斷了胼胝體，并發(fā)現(xiàn)對(duì)側(cè)神經(jīng)元活動(dòng)刺激后的腫瘤浸潤加速現(xiàn)象消失。當(dāng)選擇性激活對(duì)側(cè)L2/3層神經(jīng)元后（約80%的CPNs位于L2/3層），發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤水平增加，與全神經(jīng)元激活時(shí)相當(dāng)。這些結(jié)果表明，對(duì)側(cè)CPNs在推動(dòng)腫瘤進(jìn)展方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。

Fig.2 胼胝體投射神經(jīng)元促進(jìn)膠質(zhì)瘤的進(jìn)展

3. 活動(dòng)依賴性膠質(zhì)瘤細(xì)胞亞群

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)一群腫瘤細(xì)胞亞群，主要存在于對(duì)側(cè)神經(jīng)元活動(dòng)刺激的GBM中。對(duì)該亞群GO富集分析鑒定到 glutamatergic synapse和axon guidance。利用DSP空間轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)技術(shù)鑒定到這個(gè)活動(dòng)依賴性膠質(zhì)瘤細(xì)胞亞群的marker基因主要表達(dá)在原發(fā)癌對(duì)側(cè)的浸潤性腫瘤細(xì)胞中。前沿細(xì)胞也富集到了與axon guidance相關(guān)的基因。在IVY-GAP數(shù)據(jù)庫中，這種浸潤性特征在人GBM的前沿區(qū)域也有類似而高度特異的富集。綜上所述，神經(jīng)元刺激驅(qū)動(dòng)了浸潤性細(xì)胞群的產(chǎn)生，而這些細(xì)胞群對(duì)應(yīng)于膠質(zhì)瘤腫瘤的前沿區(qū)域。

Fig.3 活動(dòng)依賴型浸潤性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的鑒定

4. SEMA4F引導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤進(jìn)展

使用barcode screen技術(shù)從43 個(gè)axon guidance基因中進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)SEMA4F、EPHA6和EPHA7富集在對(duì)側(cè)區(qū)域和IVY-GAP數(shù)據(jù)庫中的腫瘤前沿區(qū)域。結(jié)合過表達(dá)/敲除實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)SEMA4F的過表達(dá)減少了OS，并增強(qiáng)腫瘤的浸潤，敲低后則會(huì)產(chǎn)生相反的結(jié)果。為了確定SEMA4F是否通過細(xì)胞外機(jī)制對(duì)膠質(zhì)瘤有貢獻(xiàn)，研究者過表達(dá)了SEMA4F的胞外域，發(fā)現(xiàn)可促進(jìn)腫瘤的浸潤和增殖，并且在SEMA4F敲除腫瘤中過表達(dá)該基因胞外域可挽救由于敲除導(dǎo)致的腫瘤增殖和浸潤缺陷。這些結(jié)果表明，SEMA4F通過其外胞域介導(dǎo)了活動(dòng)依賴性的膠質(zhì)瘤進(jìn)展，并通過與腦微環(huán)境的相互作用促進(jìn)了腫瘤浸潤，暗示它通過與腦部微環(huán)境的相互作用調(diào)節(jié)了這一現(xiàn)象。

Fig.4 體內(nèi)篩選鑒定SEMA4F是膠質(zhì)瘤進(jìn)展的驅(qū)動(dòng)因子

5. SEMA4F促進(jìn)大腦過度活躍

對(duì)SEMA4F過表達(dá)腫瘤進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)活動(dòng)依賴性的腫瘤細(xì)胞亞群也富集在過表達(dá)腫瘤中，并且包含axon guidance基因，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中的幾個(gè)突觸信號(hào)通路上調(diào)，包括glutamatergic synapse基因。對(duì)SEMA4F過表達(dá)的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的Bulk RNA測(cè)序也富集到突觸信號(hào)和axon guidance通路。前人研究發(fā)現(xiàn)Sema家族成員和它們的PlexinB受體可以引發(fā)突觸形成，結(jié)合該基因胞外域在腫瘤進(jìn)展中的作用，促使研究者評(píng)估SEMA4F過表達(dá)腫瘤周圍神經(jīng)元中的興奮性/抑制性突觸，以及突觸重塑方向。結(jié)果表明，抑制性突觸減少，興奮性神經(jīng)元增加，SEMA4F通過突觸重塑促進(jìn)了腦網(wǎng)絡(luò)高活躍性。上述結(jié)果暗示SEMA4F自身驅(qū)動(dòng)了這一活動(dòng)依賴性浸潤性膠質(zhì)瘤細(xì)胞亞群的產(chǎn)生。

Fig.5 SEMA4F促進(jìn)突觸重塑和大腦過度活躍

04 主要結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)位于原發(fā)性GBM對(duì)側(cè)半球的胼胝體CPNs促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和廣泛浸潤，并鑒定到了存在于人和小鼠腫瘤前沿的活動(dòng)依賴性浸潤腫瘤細(xì)胞亞群，富集了axon guidance基因。對(duì)這些基因的體內(nèi)高通量篩選確定SEMA4F是腫瘤發(fā)生和活性依賴性進(jìn)展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。此外，SEMA4F 通過將腫瘤相鄰?fù)挥|重塑為腦網(wǎng)絡(luò)過度活躍狀態(tài)，促進(jìn)活動(dòng)依賴性浸潤群體并傳播與神經(jīng)元的雙向信號(hào)。這些結(jié)果表明，遠(yuǎn)離GBM的神經(jīng)元亞群促進(jìn)了惡性進(jìn)展，并揭示了由神經(jīng)元活動(dòng)調(diào)節(jié)的膠質(zhì)瘤進(jìn)展新機(jī)制。

參考文獻(xiàn)：

Huang-Hobbs, Emmet et al. “Remote neuronal activity drives glioma progression through SEMA4F.” Nature vol. 619,7971 (2023): 844-850.