基于TimsTOF質譜優化腫瘤新生抗原的鑒定與篩選詳解
2023年11月，來自德國圖賓根大學醫學院的Juliane S. Walz教授團隊在Nature Communication上發表了關于腫瘤新生抗原鑒定的最新研究“TOFIMS mass spectrometry-based immunopeptidomics refines tumor antigen identification”。本研究基于TimsTOF質譜平臺，實現了HLA呈遞多肽的高速靈敏檢測。從94個實體組織和PBMC的原發性良性樣本中，鑒定出了大量新的HLA相關肽段數據，能夠擴展>150000 條HLA呈遞肽的良性參考免疫肽組數據庫，優化已發表的TAAs列表，以及高頻出現的自身抗原的鑒定。質譜原始數據使用PEAKS Xpro完成搜庫分析（劃重點：文末，我們使用文獻原始數據進行了PEAKS DeepNovo Peptidome workflow的分析結果對比）。
首先通過控制變量法，優化了基于TimsTOF液質聯用平臺的液相色譜流動相配比、流出梯度時長與質譜采集參數，使用最優條件下的參數組合進行后續臨床樣本的分析。并且比較了TimsTOF和Orbitrap Fusion Lumos對HLA I型和II型肽段的檢出性能，發現TimsTOF能鑒定出更多獨有的HLA肽段（圖1）。
圖1 TimsTOF平臺不同實驗參數及與Orbitrap結果對比
分別收集28種不同的實體器官組織和PBMC的良性樣本用于大規模良性參考免疫肽組分析（HLA class I n=92，HLA class II n=94），且99%的捐獻者至少表達一種HLA分型，最終全部樣本共同鑒定到137463條HLA I型配體和175469條HLA II型呈遞多肽，且統一個體的不同組織之間具有明顯的異質性（圖2）。
圖2 94例良性樣本的免疫肽組鑒定
與IEDB數據庫和已發表的Orbitrap最新鑒定的良性組織免疫肽數據（n=297）相比，本研究分別有46% HLA class I和54% HLA class II多肽未曾被報道，且這些多肽具有更強的疏水性，而氨基酸組成和生物學相關性與已發表的HLA呈遞多肽并無明顯差別（圖3）。
圖4 RCC和HNSCC比較分析
最后，為了驗證BenignIMS數據集對于TAAs篩選的應用示例，分析了22例原發性CLL樣本的HLA免疫多肽組。所有樣本共同鑒定到121871條HLA class I多肽和86785條HLA class II多肽，通過與已發表的良性數據集比對，保留了68% HLA class I（83074）和72% HLA class II （62224）惡性CLL特異的TAAs。進一步與本研究前述的BenignIMS數據集比對，又篩選出來良性組織涵蓋的46% HLA class I（55812）和68% HLA class II（49147）多肽，因此，BenignIMS數據集，又分別額外注釋了27262和13077條HLA class I和HLA class II良性肽段（圖5e-f）。并且，在本研究篩選的CLL特異的、高度可能被用作免疫治療抗原靶點的TAAs中，有98%是先前未曾報道過的。最后，作者還進行了由腫瘤特異性突變導致的自然表達的新生抗原表位的篩選，以全外顯子測序數據作為參考數據庫，結果鑒定到了其他已發表的數據從未報道過的兩條突變抗原表位：(LPADVTEDEF SFPQ_HUMAN304-313 I308V和VYPLAFVLI MD13L_HUMAN279-287 S282L) ，并通過肽段的同位素合成進行了驗證（圖5 g-h）。
圖5 與已發表數據集鑒定結果對比
PEAKS 11中，已加入針對免疫肽組學數據分析專門的工作流——DeepNovo Peptidome workflow，其中應用的深度學習算法經過大量已發表的質譜數據訓練，極大地擴展了免疫肽組學數據挖掘的深度。我們下載了文獻中的良性組織原始數據，在PEAKS 11軟件中進行了重新分析，結果顯示，DeepNovo Peptidome workflow可以比傳統的搜庫法多鑒定30%的多肽，且經過HLA Ligand Atlas9良性數據庫檢索，UDN12良性組織多鑒定的肽段很大部分是屬于natural HLA ligands，在CLL05的惡性樣本中，也鑒定到了少量良性ligands，這些均可以作為TAAs篩選的排除參考。
- 良性淋巴組織
- 慢性淋巴細胞白血病樣本
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9.https://hla-ligand-atlas.org/welcome
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