編者按

近年來，單細胞轉錄組的出現使得研究者的視角從組織水平轉向細胞水平，而空間轉錄組能夠給出每一種細胞類型的空間位置信息，這兩種技術運用也越來越廣泛，包括類器官研究領域。2024年5月13日，復旦大學腦科學轉化研究院邵志成研究員團隊在 Cell Reports Methods 期刊發表了題為《Effective cryopreservation of human brain tissue and neural organoids》的研究論文。本文章使用單細胞轉錄組技術解析了冷凍保存和正常類器官中的細胞類型變化，更加有力的證明了冷凍技術的可行性。

Fig.1 類器官單細胞轉錄組/空間轉錄組研究思路

01 文章背景

研究腦部疾病新型藥物的人力和經濟成本非常高，超過90%的腦部疾病候選新藥無法真正應用到臨床中，其主要挑戰之一是將新藥從動物模型試驗轉向人源模型。隨著類器官技術的發展，腦類器官在研究人類大腦發育、模擬腦部疾病和開發新藥方面展現出了巨大的潛力。然而，需要長期培養的腦類器官由于成本和儲存問題極大的限制了其在生物醫藥研究中的應用，可靠的類器官模型應該具備新鮮人腦的自然病理特征。因此，開發出一種適用于腦類器官/腦組織的低溫保存方法對推動腦科學基礎和臨床轉化研究具有十分重要的意義。

02 文章詳情

文章題目：Effective cryopreservation of human brain tissue and neural organoids

中文題目：人類腦組織和神經類器官有效凍存新技術

發表時間：2024.5

期刊名稱：Cell Reports Methods 

實驗平臺：10x 單細胞轉錄組、類器官

DOI：10.1016/j.crmeth.2024.100777

03 研究內容

1. 通過MEDY有效地低溫保存人體皮質類器官

研究團隊通過精準控制冷凍介質的成分和凍融過程開發了一種新型的低溫保存方法。選擇了多種具有維持類器官形態完整性、減少神經元細胞死亡/保護軸突生長潛力的冷凍介質的成分。并通過添加小分子抑制劑（Y27632）來提高類器官凍存的保護效果，然后通過對復蘇后類器官軸突生長狀態、神經元生長狀態以及凋亡比例的對比分析，作者最終確定了1%甲基纖維素 + 10%乙二醇 + 10% DMSO + 10 μM Y27632 （MEDY）是腦類器官的最佳冷凍介質。

Fig.2 不同冷凍保存介質對復蘇后腦類器官的影響

2. MEDY能夠在低溫保存后維持皮質類器官的功能活性和細胞多樣性

心室區（VZ）樣結構和多個皮質層在維持大腦類器官的功能方面發揮著重要作用，其功能結構完好是發展低溫保存技術的關鍵問題。使用MEDY冷凍皮質類器官，解凍后繼續培養21天、50天后，類器官功能結構被完全保留，且在低溫保存1年半的類器官中祖細胞和神經元依然能夠維持良好。通過對類器官進行了bulk轉錄組測序和單細胞轉錄組測序證明神經標志物的基因表達譜以及主要的神經細胞亞群沒有明顯變化。然后通過鈣成像技術證明低溫保存的類器官仍具有功能性神經元活性，其連通性得到了基本的保護。這些結果進一步表明，MEDY超低溫保存不會破壞細胞群多樣性、基因表達、細胞空間位置分布以及功能活性。

Fig.3 MEDY保留腦類器官的功能結構、細胞活性

3. 低溫保存的類器官的長期培養活性

低溫保存技術對長期培養的類器官具有重要的作用。因此作者將培養到77，90，100天以上的類器官使用MEDY冷凍保存，解凍后進一步培養，發現神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞依然能夠很好的維持，并且進一步培養依然具有很強的鈣活性。這些結果表明，MEDY超低溫保存可以用于儲存長期培養的皮質類器官。

Fig.4 MEDY超低溫保存可用于保護長期培養的皮質類器官和SP類器官

4. MEDY低溫保存在多種腦區特異性類器官、腦組織中的應用

使用MEDY培養基將誘導出的背/腹側前腦（GABA）類器官、脊髓（SP）類器官和視神經（OVB）類器官培養至第30天左右進行冷凍，免疫熒光染色結果標明，這些腦區特異性類器官的細胞多樣性和結構同樣得到了良好的保存，表明該培養基適用于福哦中腦區類器官的保存。進一步在癲癇患者源性腦類器官以及3D腦組織進行冷凍保存及驗證，發現其神經元等細胞保存良好，并且保留了完成的病理結構。說明MEDY可以應用于腦類器官組織和活腦組織的冷凍保存。最后，研究團隊通過轉錄組學分析發現，MEDY通過抑制內質網介導的細胞凋亡途徑從而保護突觸功能，實現在低溫狀態下對腦類器官的保護作用。

Fig.5 MEDY低溫保存適用于保存癲癇兒童來源的皮質類器官和活腦組織

總之，本研究找到了一種人類腦組織冷凍保存新方法，可以完成腦類器官、腦區域特異性類器官、癲癇患者源性腦類器官以及3D腦組織冷凍保存。對減少神經類器官的制備時間和成本，實現各種神經類器官和活體腦組織的大規模存儲提供可能性，并能夠有效促進腦科學基礎研究、神經類器官移植治療和藥物評估與篩選。

單細胞技術應用于類器官培養后的驗證，藥物治療機制，耐藥性研究中具有重要的地位，同年四月份在Cell reports發表的題為《Generation of human cerebral organoids with a structured outer subventricular zone》的研究論文，同樣使用單細胞轉錄組技術研究腦類器官對照組和實驗組的細胞類型和分子表達譜，為文章研究提供了更精細的分析角度。而單細胞分辨率的空間多組學技術的出現，也許會為類器官的空間分布和原組織的相似性提供更多的驗證手段。

類器官研究思路參考