原創:孔維國等 文章來源：中華結核和呼吸雜志

作者：孔維國 林欣 朱俊豪 林澤強 朱思源 張子麗 盧文菊

單位：廣州醫科大學附屬第一醫院呼吸疾病國家重點實驗室 國家呼吸醫學中心 廣州呼吸健康研究院；廣州醫科大學

引用本文: 孔維國, 林欣, 朱俊豪, 等. 肺泡類器官在常見肺疾病中的應用研究進展[J]. 中華結核和呼吸雜志, 2023, 46(8): 829-834. DOI: 10.3760/cma.j.cn112147-20230501-00207.

摘要

類器官是將組織細胞通過3D培養形成的一種能高度模擬體內生理病理狀態的組織培養物，有助于研究體內組織器官發生發育過程中細胞時間和空間維度的變化，探究各種危險因素導致細胞功能及通訊的改變，發現潛在的治療靶點。本文綜述肺泡類器官的培養、鑒定方法，及在肺纖維化、慢性阻塞性肺疾病及病毒性肺炎等常見呼吸疾病中的應用研究進展，分析討論肺泡類器官使用的局限性和未來主要的應用方向。

類器官技術是一種新型三維（three-dimensions，3D）細胞培養技術，通過在體外培養誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）、胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESC）或成體干細胞（adult stem cells，ASC）進行分裂與分化，形成與其來源的特定組織或器官相似的體外模型，該體外模型即為類器官。近年來類器官技術呈飛躍式發展趨勢，目前已經成功建立肺、氣道、腸道、胃、腎臟、大腦等類器官模型［ 1 ］，類器官不僅能高度模擬體內細胞生長環境，保持細胞生長的空間結構，而且能更好地代表來源組織器官的生理功能和生物學特性［ 2 ］，有助于深入研究各種分子和信號通路對器官形成過程在不同時期的作用［ 3 ］。

在多種肺部疾病的發生發展過程中，伴隨著肺泡結構不同程度的病變，如慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）、特發性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）以及近年來波及全球的新型冠狀病毒感染性肺炎（簡稱新冠肺炎）等。傳統的體內外實驗模型能夠一定程度上還原人體肺泡結構的變化情況，但生物學特性仍有許多不同，利用新型模型模擬人體肺泡層面更為真實的變化情況迫在眉睫。肺泡類器官是指肺干細胞3D支持培養下形成的類似于肺泡細胞類型和結構的培養物，該類器官表達肺泡上皮細胞標志物且包含部分肺間充質細胞。目前針對肺泡類器官的不同處理已在多種涉及肺泡病變的肺部疾病有了廣泛研究進展［ 4 , 5 , 6 ］。

一、肺泡類器官培養體系

肺泡類器官的培養基于Ⅱ型肺泡上皮細胞（type Ⅱ alveolar cells，ATⅡ）所具有的多能干細胞特性。ATⅡ主要通過流式細胞分選技術（flow cytometry sorting，FCS）［ 7 , 8 ］和磁珠分選法獲取。除了ATⅡ本身之外，肺泡類器官的培養體系還需要添加其他共培養細胞或細胞因子。最初使用的有PDGFRα+成纖維細胞［ 7 , 8 , 9 , 10 ］等。現多在類器官基礎培養基中添加有利于ATⅡ增殖及分化的細胞因子，最常使用的基礎培養基為DMEM/F12，添加的細胞因子主要有成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）2和10、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、Noggin、R-spondin-1、Y-27632、CHIR 99021、SB 431542等［ 11 , 12 ］，具體添加的種類以及用量需要根據培養目的進行相應調整。肺泡類器官3D結構的形成需要一定的支撐體系，目前使用最為廣泛的為基質膠［ 13 ］。除基質膠以外，近期有文獻報道了一種使用透明質酸水凝膠培養肺泡類器官的方法，該方式能夠有效減少肺泡類器官大小及結構的不均一性［ 14 ］，未來有潛力成為基質膠的替代品。目前肺泡類器官的培養體系仍在不斷更新迭代，對不同細胞因子和支撐物等研究越來越多，隨著研究的不斷深入和技術的不斷革新，肺泡類器官作為一種理想的新型模型在肺部疾病的探索征途上扮演著越來越重要的角色（ 圖1 ）。

二、肺泡類器官的優越性

傳統的實驗方案主要通過體外培養各種肺部細胞并給予一定條件刺激、構建動物疾病模型等模擬人體各種肺部疾病開展研究，然而體外細胞培養與體內環境仍有較大區別，相對于組織及器官層面細胞培養不能很好地反映體內多因素對疾病發生發展的潛在影響。動物模型能夠在部分程度上還原疾病在人體內的表現和作用機制，然而不同種類的動物在肺部結構上與人體存在部分差異，如人體氣道遠端分支于肺泡氣體交換生態位交織形成呼吸道細支氣管，小鼠中卻缺乏這種結構［ 15 ］。利用類器官構建肺部疾病模型在一定層面上克服了傳統體內外模型的不足之處，其培養來源細胞可通過多種途徑從人體分離獲得，在短期內即可培養出大量類器官結構［ 16 ］。類器官適用于研究多種肺部細胞間的相互作用，從整體的層面反映疾病因素所導致的多種細胞機制變化［ 17 ］。肺泡類器官在正常生理中有助于探索人體內肺泡結構發生發育過程中肺泡細胞時間維度的變化，如何實現肺泡結構的重建是肺再生的研究重點之一；在病理層面探究各種危險因素導致肺泡細胞功能及通訊的改變有助于發現潛在的治療靶點。因此，肺泡類器官作為新型工具在涉及肺泡病變的疾病研究中存在廣泛的優越性（ 表1 ）。

三、肺泡類器官在常見肺疾病中的應用研究進展

1. 肺纖維化：肺纖維化是一種慢性的、進行性發展且預后不佳的致死性間質性肺疾病，其中最嚴重以及最常見的一種為特發性肺纖維化。IPF的發病機制基于最初的肺泡上皮損傷，隨后表現為成纖維細胞、肌成纖維細胞過度增生和細胞外基質（extracellular matrix，ECM）過度積累，進而破壞了肺的正常生理結構以及功能［ 18 , 19 ］。運用類器官技術在IPF的相關研究近年來不斷增加（ 表2 ）。

最初的類器官IPF模型主要包含肺泡上皮細胞、間充質細胞以及各種肺部其他細胞。Wilkinson等［ 20 ］首次利用包含肺泡上皮細胞的肺類器官建立體外IPF模型。在功能化的藻酸鹽珠周圍搭建包括間充質細胞、肺泡上皮細胞等多種細胞構建人iPSC（human iPSC，hPSC）來源的肺類器官，用TGF-β處理之后發現能夠生成高水平Ⅰ型膠原以及a-SMA的局部斑塊，類似于IPF患者中的成纖維細胞病灶。與此不同的是，Surolia等［ 21 ］通過手術活檢獲得正常人和IPF患者的部分肺組織后提取細胞懸液制備成肺球樣類器官，包含了ATⅡ（SFTPC+）、肌成纖維細胞（a-SMA）等細胞，在來源于IPF患者的類器官觀察到明顯的侵襲性肌成纖維細胞區域，與正常組相比細胞外基質蛋白表達具有差異性，這種構建方法更利于針對不同患者進行個性化治療方案的設計。Hermansky-Pudlak綜合征（Hermansky-Pudlak syndrome，HPS）是一種常染色體隱性疾病，絕大多數患者表現出類似于IPF的臨床病變，Strikoudis等［ 22 ］將包含大量ATⅡ以及少量間充質的hPSC運用CRISPR/Cas9技術使多個HPS基因發生移碼突變后進行特定培養，產生了具備纖維化表型的類器官，從而提供了一個新的研究模型以更好地確定IPF的發病機制。Suezawa等［ 23 ］采用FCS將hPSC分選出SFTPC+細胞后，對衍生的肺泡類器官給予BLM刺激，在該模型中觀察到ATⅡ、ATⅡ-ATⅠ中間狀態細胞發生衰老、成纖維細胞激活、類器官整體收縮和細胞外基質的積累，類似于IPF中的纖維生成。肺泡類器官IPF模型的構建目前通過給予致纖維化因子或藥物，以及特定基因突變誘導產生類似于體內外實驗模型的表型，為IPF的研究擴展出一條新的道路，然而多種處理方式所產生的類器官病變仍存在部分差異，且涉及機制具有不同之處，因此圍繞研究內容選擇合適的處理方式尤為重要。2. 慢阻肺：慢阻肺是一種可預防可治療，以持續存在的呼吸道癥狀和氣流受限為特征的常見疾病［ 24 ］。在中國，目前接近有1億人患有不同程度的慢阻肺，因其死亡的人數在單病種致死排序中排到了第三位［ 25 ］。隨著病情進展，慢阻肺患者肺泡上皮細胞修復功能的進行性障礙促進了肺氣腫的發生和發展，因此尋找合適的肺再生方法尤為重要。其中，運用類器官模擬慢阻肺模型研究肺泡上皮細胞的轉分化機制近年來被廣泛認可并采納（ 表2 ）。由于吸煙是促進慢阻肺發生發展最主要的危險因素，因此常給予香煙煙霧（cigarette smoke，CS）以及香煙提取物（cigarette smoke extract，CSE）刺激分別構建疾病的體內體外模型。在一項將小鼠長期暴露于CS模擬慢阻肺的研究中，使用離體肺泡類器官模型來探索一種被稱為“序列相似成員13A家族”（family with sequence similarity 13 member A，FAM13A）的基因的作用，肺泡類器官由熏煙處理的FAM13A+/+和FAM13A-/-小鼠產生。結果顯示，FAM13A的缺失與ATⅡ的增殖分化以及肺泡類器官生長趨勢增加有關，暴露于CS中時，FAM13A缺失會上調ATⅡ中WNT的激活，并且相比FAM13A+/+小鼠發育出更多的肺泡類器官［ 26 ］。另一項研究中，通過體外3D培養原代小鼠ATⅡ構建肺泡類器官，給予不同濃度的CSE刺激一定時間后，發現達到CSE毒性濃度之前，增加CSE濃度能夠激活ATⅡ細胞的干細胞功能，包括誘導其更快速的增殖和分化，增強對凋亡的抵抗力，形成體積更大、數量更多的肺泡類器官［ 27 ］。空氣污染也是促使慢阻肺進展的重要因素，Yu等［ 28 ］將PM2.5加入在肺泡類器官的生長培養基以及分化培養基中，發現PM2.5處理后引起了肺泡類器官的損傷，ATⅡ的增殖水平升高但修復功能受損，ATⅠ與ATⅡ的比值明顯下降，表明抑制了ATⅡ細胞進入轉分化的過程。Wu等［ 29 ］使用不同濃度柴油廢氣顆粒（diesel exhaust particles，DEP）連續處理小鼠以及人肺泡類器官14 d后，發現類器官的體積及數量均顯著減少，且與Wnt/β-catenin信號通路的下調有關。由于慢阻肺致病因素的復雜性，體內外有多種造模方式，然而具有局限性。給予肺泡類器官各種有害顆粒提取物處理后得到的結果與大多數體內外疾病模型具有一致性，且能更直觀地展現肺泡上皮細胞的慢性演變，因此有望被廣泛應用于慢阻肺發病過程及肺再生的機制研究。3. 新冠病毒感染及肺炎：新冠病毒肺炎是由嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型引起的呼吸道感染性疾病，至今仍在全球范圍內不斷蔓延［ 30 ］。截至2023年1月22日，全球報告確診病例超過6.64億例，死亡病例超過670萬例［ 31 ］。部分患者感染新冠病毒后會引起彌漫性的肺泡損傷，進而導致嚴重的急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）［ 32 ］，為了解其具體的發病機制，近年來國內外學者們利用肺泡類器官創建了多種體外病毒感染模型以深入研究（ 表2 ）。最初開發的類器官模型用于藥物篩選。Han等［ 33 ］將hPSCs培養成包含ATⅡ的肺類器官后，利用其表達ACE2的特性使培養物感染新冠病毒后進行轉錄組測序分析，發現多種趨化因子和細胞因子有較高的表達水平，且幾乎沒有I/Ⅲ型干擾素（interferon，IFN）信號的表達，這與新冠病毒肺部感染的患者觀察到的情況類似，使用伊馬替尼和霉酚酸能夠減緩病毒對類器官的感染。同年7月，Salahudeen等［ 34 ］采用去除ECM懸浮培養的方法，培養出外層為肺泡上皮細胞的類器官球體，免疫熒光結果顯示ACE2定位于類器官外表面的細胞膜，用新冠病毒感染后發現肺泡類器官中約10%的SPTPC+細胞有明顯的新冠病毒核衣殼蛋白表達，證明ATⅡ能夠直接被病毒所感染。Katsura等［ 35 ］確定了成人肺泡干細胞長期擴張和分化的條件后，構建了可被新冠病毒直接感染的肺泡類器官，發現感染后的類器官與新冠病毒感染后的肺部特征相似，如IFN介導的炎癥反應出現、表面活性蛋白的缺失和細胞凋亡，此外用低劑量IFN預處理肺泡類器官觀察到病毒復制的減少，表明其對新冠病毒的預防作用。Pei等［ 36 ］也證明了新冠病毒可以感染肺泡類器官中一類特定亞群的ATⅡ，轉錄組測序結果顯示在病毒感染后脂質代謝過程下調，此外還發現瑞德西韋可有效抑制新冠病毒在類器官中的復制。上述多項研究已共同證明新冠病毒感染肺泡類器官的體外模型已成功構建，在已有的動物、細胞模型基礎上，為后續肺泡上皮病變機制研究、抗病毒藥物篩選提供了一種新型且有效的工具。未來可聚焦于病毒感染肺泡類器官后結合轉錄組學、代謝組學等多組學聯合分析，探索不同毒株所引起肺泡病變所具有的差異性。

四、展望

類器官技術的出現有效地填補了體外模擬人類器官在疾病狀態變化方面的空白。隨著類器官培養技術的發展，在多種涉及肺泡病變的肺部疾病中，包括IPF、慢阻肺以及新冠病毒引起的肺部感染，研究人員可通過直接分離患者或疾病模型體內的肺泡干細胞后培養成類器官，輔以CRISPR/Cas9技術構建合適的疾病模型；也可對正常狀態的肺泡類器官給予致病因子、藥物或病毒進行刺激，以模擬這些致病因素對肺泡類器官結構和功能的影響。目前應用肺泡類器官為疾病在肺泡結構層面所產生的病理生理變化、發病機制和相關信號通路提供了新的研究方法，有助于針對各疾病的相應靶點篩選有效藥物從而進一步推進臨床試驗研究。不只于肺泡類器官，隨著各種類器官的培養條件不斷成熟化、標準化，這種新型體外培養模型將被越來越多的研究人員所掌握并運用在基礎研究中；在臨床診療中，未來針對不同的患者提取病變部位具有干細胞活性的成體細胞，培養對應的類器官結構后制定個性化治療方案，有望成為更安全、更有效的一種策略。