原創 ：子苓，向陽飛文章來源： 合成生物學期刊

引用本文: 陳子苓, 向陽飛. 類器官技術與合成生物學協同研究進展[J]. 合成生物學, 2024, 5(4): 795-812

Citation: CHEN Ziling, XIANG Yangfei. Integrated development of organoid technology and synthetic biology[J]. Synthetic Biology Journal, 2024, 5(4): 795-812

DOI: 10.12211/2096-8280.2023-106

摘 要

類器官由成體干細胞或多能干細胞在體外分化而來，可以在細胞類型、空間結構及生理功能上實現對體內組織器官的模擬。類器官的構建及技術完善，推動了發育生物學、遺傳學、病理毒理學等發展。合成生物學是一門多學科交叉的新興學科，以工程學思想為指導，旨在通過工程化、模塊化的方法設計、改造、構建生物元件、系統、功能等。近年來類器官構建的優化方案體現了與合成生物學契合的研究理念，而合成生物學的發展及相關方法的產生也為類器官技術的發展起到了推動作用。本文將概述類器官和合成生物學的發展歷程與面對的挑戰，探討類器官優化過程中合成生物學策略的體現與新興的合成生物學工具對于類器官在時空命運調控、結構自組織及功能形成等方面的優化作用，簡述基于類器官模型的研究對于合成生物學發展的促進作用。總的來說，本文旨在闡述合成生物學與類器官構建及優化之間相輔相成、互相促進的關系，并進一步探討合成生物學與類器官在未來結合應用的潛力。

全 文

類器官（organoid）作為近年來生命科學研究的重要技術突破之一，在實現多能干細胞（pluripotent stem cell，PSC）或成體干細胞（adult stem cell，ASC）在體外分化出具有特定功能的細胞類型的同時，也能夠建立三維（three-dimensional，3D）空間組織，從而重現體內器官的結構與功能。類器官彌補了二維（two-dimensional，2D）細胞培養在表現體內組織結構復雜性上的不足，擁有與體內對應器官相似的細胞構成、組織結構特征，能呈現較為復雜的生理功能，是體外模擬發育及疾病發生發展的重要工具。類器官模型的建立，使得在體外還原對應組織器官的細胞類型、基因表達、組織結構、生理功能及多種生物學過程成為可能。

合成生物學（synthetic biology）是系統生物學與基因技術、工程科學、合成化學、計算機科學等眾多學科交叉融合所催生的新興學科，以基因組和生化分子合成為基礎，綜合生物化學、生物物理和生物信息等技術，通過工程化、模塊化的方法，旨在設計、改造、重建生物分子、生物元件和生物分化過程，從而構建具有生命活性的生物元件、系統以及人造細胞或生物體。

隨著類器官技術的不斷發展和對復雜類器官構建的需求日益增加，現有類器官構建方法的單一性、高可變性等缺陷逐漸顯露，需要拓展新的思路來實現類器官培養的優化。而合成生物學系統化、模塊化、高通量的基本理念恰好契合類器官構建與改良的需求。本文將簡要概述類器官的發展歷程，聚焦當下前沿的類器官構建體系中合成生物學思路的體現，以及類器官技術發展對合成生物學的潛在推動作用，闡述類器官與合成生物學之間相輔相成、相互促進的關系，并展望二者融合碰撞所能產生的多種可能性。

1 類器官及合成生物學發展概述

1.1 類器官技術的起源及發展

類器官是基于多能干細胞或成體干細胞建立的體外3D培養物，具有人體相應器官或組織的結構和功能特征。雖然“organoid”一詞直到1946年才首次出現在文獻報道中，但對于類器官的研究，最早可以追溯到20世紀初。1907年，有研究表明解離的海綿細胞在合適的條件下可以自組織成細胞團，并分化出新的個體。隨著研究的不斷深入，對細胞自組織的研究逐漸從無脊椎動物擴展到兩棲動物、禽類乃至哺乳動物。2008年，Eiraku等使用3D聚集培養方法將胚胎干細胞分化為大腦皮層類似組織。2009年，Sato等的研究表明，特定條件下的成人腸干細胞可以在基質中形成3D的小腸類器官，在沒有間充質的情況下可以自組織并分化出小腸微絨毛結構。這一具有里程碑意義的研究為之后許多類器官相關研究奠定了基礎，在此之后，針對不同胚層發育，包括胃、腎臟、肝臟、胰腺、肺、大腦和視網膜等，研究人員陸續建立了對應的類器官培養方案[圖1(a)]。

圖1 類器官(a)及合成生物學(b)研究的重要時間節點

1.2 類器官模型的優勢與局限性

近年來，越來越多的類器官模型得到了成功構建，尤其是單一譜系來源的正常組織類器官或是病理性類器官模型，目前已經有了相對成熟穩定的培養方案，這些為人體組織器官發育、功能、疾病的研究提供了重要資源，同時對再生醫學和基因治療領域的發展也具有相當有力的推動作用。

相比于傳統的2D細胞培養和動物模型，類器官可以提供更加接近人體內組織結構的3D微環境，重現體內組織器官的細胞類型組成與功能。在疾病模型的構建中，使用患者自體來源的細胞培養類器官，可以實現藥物在特定個體中的療效評估。此外，患者自體來源的類器官，也許能為患者提供可降低免疫排斥反應的適合移植的組織，在損傷的再生修復以及器官移植領域有著廣闊的前景。

盡管類器官目前已經可以在一定程度上模擬體內組織的細胞組成、結構與功能，但距離實現對體內真實復雜生理結構精確、穩定的模擬，仍然有很長的一段路要走。此外，體外分化所培養的類器官在發育過程中往往存在明顯的異質性，個體類器官之間的重復性較低，生成類器官的時間成本及資源成本均十分高昂，因此如何提升類器官開發的精確性、穩定性以及分化效率是目前類器官研究面臨的一大關鍵挑戰。與此同時，單一譜系來源的簡單類器官已經無法滿足日益增長的以類器官作為工具研究或重現體內多譜系、多組織類型甚至是多系統之間的發育、組裝乃至互作的需求，因此更復雜、更綜合的類器官系統的構建成為了當下類器官技術的研究難點。想要攻克上述挑戰，建立起具有較低可變性、較高分化效率、較穩定的可控性且擁有復雜穩定結構的類器官培養方案，則要求研究人員能夠實現對類器官培養體系（包括細胞命運及細胞外微環境）精準、工程化的時空調控。這一需求與合成生物學的研究理念、研究目的高度一致。

當下，類器官培養體系的設計已經開始逐步展現出系統化、工程化的特點，一定程度上與合成生物學的研究理念產生了契合，而合成生物學領域的發展與越來越多的合成生物學工具的開發，也為更復雜、更精準的類器官構建提供了全新的角度與思路。此外，伴隨著類器官技術的發展，以類器官作為平臺所開展的許多研究，如類器官轉錄組圖譜的構建、CRISPR篩選等，也可以推動與指導合成生物學的發展。

1.3 合成生物學的起源

分子生物學相關技術的發展，使得研究人員可以在體外對細胞或生物體的基因進行操控，促進了合成生物學的發展。2000年，Collins團隊受噬菌體λ開關和藍藻晝夜節律振蕩器的啟發，設計合成了雙穩態基因網絡開關；同年，Elowitz和Leibler基于負反饋調控機制實現了基因振蕩網絡的設計；2002年，Wimmer團隊通過化學合成病毒基因組獲得了具有感染性的脊髓灰質炎病毒，這也是首個人工合成的生命體；2010年，Venter團隊設計、合成和組裝了1.08 Mb的支原體基因組（JCVI-syn1.0），并將其移植到山羊支原體受體細胞中，產生了僅由合成染色體控制的新支原體細胞；2014年，Romesberg團隊設計合成了一個非天然堿基配對，并將它們整合到大腸桿菌基因組[圖1(b)]。這些研究表明，對生物系統進行精準的設計與調控，將進一步加深對于生命系統的理解，拓展生命系統的可能性。

1.4 類器官與合成生物學的區別與聯系

類器官與合成生物學均為生命科學近年來興起的新興發展學科，在生物醫學研究中也逐漸展現出了廣闊的發展前景，二者有所聯系又互不相同。從研究目的上看，類器官構建目標是通過調控干細胞在3D培養條件下分化與自組裝，盡可能在體外還原體內組織或器官的真實細胞類型、細胞組成、形態結構、發育過程以及功能。而合成生物學則是在現有系統的基礎上重新進行設計和改造，使之增加新的功能，或重新構建全新的生物元件與系統。前者強調體內真實組織的還原與重現，后者注重的是生物系統的重建與改造。

從研究方案上來看，傳統類器官的構建通過模擬體內正常生長分化過程的外源信號線索以及相應的基因表達模式，利用干細胞自我更新與分化的能力，實現類器官模型的體外構建。而合成生物學則是依托于對天然生物元件及其相互作用的理解，重新設計、修改、重構生物元件和系統。

類器官與合成生物學兩大研究方向并沒有明晰的界限，前者可以幫助合成生物學研究人員更好地了解天然的生物系統中存在的分子機制以及相互作用的原理，后者可以在構建類器官過程中實現對部分復雜功能的精準調控。盡管目前合成生物學在類器官中的應用還處于嘗試階段，但已展現出其明確的優勢。探索合成生物學與類器官的區別與聯系，并進一步闡述類器官構建過程中合成生物學的策略體現以及合成生物學工具在類器官中的應用，可以明確兩個研究方向相輔相成的關系，突破現有的研究瓶頸，推動兩個方向的發展與創新。

2 類器官構建中的合成生物學策略的體現

合成生物學研究與應用可體現為兩種形式：一是“自上而下”的方法，通過對現有的、天然存在的生物系統進行重新設計和改造，修改已存在的生物系統，使之增添新的功能；二是“自下而上”的方法，通過設計和構建新的生物元件、組件和系統，創造自然界中尚不存在的人工生命系統。

本節將以經典的類器官構建案例以及類器官模型的應用，來闡述類器官構建及優化方案（圖2），以及合成生物學基礎路線和研究方法在類器官研究中的基本體現，進一步說明合成生物學與類器官在研究思路與研究方案方面的區別與聯系。

圖2 類器官構建與優化策略

2.1 類器官構建中微流控技術的應用

在體內，胚胎發育過程中組織或器官的發育受到嚴格的時空動態調控。通常來說，類器官的形態發生過程也會受到外部微環境因素的控制，干細胞在特定的時間點暴露于特定的外源性形態發生因子或生長因子時，往往存在相應的發育信號通路的激活，從而觸發特定類型細胞的分化與自組織。通過對生理微環境因素的精確時空控制，改變類器官培養體系中外源因子的組合模式和劑量，是構建不同類器官模型的基本思路。

早期的細胞2D分化研究是3D類器官構建的基礎，結合3D培養的幾種方法，包括嵌入細胞外基質（ECM）和懸浮培養等，可使體外模型的構建由2D轉變為3D，從而更好地還原組織器官的結構與功能。目前，類器官最常見的設計思路是通過對體內不同組織器官發育過程的理解，借鑒內源性發育調控與穩態維持的基本原理，在體外模擬細胞組成與調控信號，調控干細胞的增殖與分化，從而建立對應特定組織或器官的3D模型。

2009年，荷蘭科學家Hans Clevers等在體外成功利用小鼠Lgr5+腸道干細胞構建了小腸類器官，該研究建立的小腸類器官在很大程度上重現了體內小腸組織的細胞類型與3D結構，并能夠基本準確地模擬小腸上皮的生理情況。該研究極大推動了類器官技術的發展，它證明了通過體內分化條件的模擬，可成功實現細胞的體外分化調控，為其他組織或器官的體外3D培養提供了可靠的實驗性依據。此后，研究人員實現了不同類型3D培養，建立了多種人類正常和病理性類器官，如前文提到的腦、結腸、胃和肝臟類器官等。

盡管目前針對體內多種組織與器官已經有了對應的分化方案與類器官模型，但僅通過向培養基中添加誘導因子來控制特定信號通路的激活或抑制，從而實現類器官誘導分化的傳統構建思路也面臨明顯的局限性。對類器官的構建而言，在分化的不同時間點添加不同的誘導因子可實現對干細胞命運決定的時間調控，但空間上非對稱的信號調控，例如體軸發生過程中形態發生因子的梯度協同作用則難以模擬。此外，常規的類器官培養策略也難以模擬體內微環境中物理因素（如機械應力等）對于組織器官發育的影響。在類器官的應用層面，將類器官模型應用于藥物篩選或療效驗證研究時，通常需要繁瑣的人工操作與較長的培養時間。不僅如此，樣品個體、批次之間在組織結構、細胞組成等方面存在較大的異質性，這也將影響實驗的可重復性。此外，分析通量低也是目前類器官研究中亟待解決的困難。

針對以上問題，微流控技術被引入類器官培養中。器官芯片可以控制流體流動，結合細胞與細胞相互作用、基質特性、生物化學和生物力學等調控，在時間尺度上實現對細胞命運調控的同時，引入空間等多種變量，可更準確地在體外模擬內源組織的分化環境，也使得組織器官之間的相互作用及復雜功能得以更好實現。2016年，Christopher J. Demers等開發了一種微流控裝置，可以在類器官培養中產生形態發生因子梯度，模擬生理狀態下的形態梯度來分化產生神經管模擬物。Rifes等利用微流控裝置中的Wnt梯度生成了一種具有喙尾組織特征的神經組織，并將其用于模擬早期人類神經管的發育。在成功實現了類器官構建過程中空間上的信號調控的同時，也有研究致力于探索組織器官形成過程中物理因素對類器官生長發育及功能的影響。例如，通過人胃類器官的管腔流可以有節律地向類器官引入可控強度的拉伸和收縮，模擬體內胃功能，用于人體胃生理學研究、疾病建模和藥物篩選。

除此之外，還有更多研究致力于在微流控裝置中整合類器官生長所需的物理或生化因素。2019年，Morizane團隊通過設計3D打印的微流控芯片，在類器官培養過程中引入了可控的流體剪切力，在體外成功構建了腎類器官。相比于靜態培養，該腎類器官極大擴展了內源性內皮祖細胞池，生成了由壁細胞包圍的可灌注管腔的血管網絡，且具有更成熟的足細胞和腎小管。2018年，秦建華團隊構建了一種包含微柱陣列結構的可灌注微流控裝置，該裝置可實現人多能干細胞向肝類器官分化的誘導。此種方法下產生的肝類器官具有更高的細胞活力與成熟度，且肝特異性功能顯著增強。2019年，一種可灌注的胰島類器官微流控芯片被建立，該芯片具有多層結構，可以在單一設備中實現可控的類胚體形成、原位胰島分化、胰島類器官的形成與長期培養。與靜態培養的胰島類器官相比，該可灌注芯片培養分化的胰島類器官具有更完整的結構、更高的細胞活性以及更強的胞間連接。

除細胞的時空命運調控與物理因素的模擬外，微流控技術結合不同器官芯片的開發，也為類器官的構建提供了高通量、高均一性、自動化、工程化的可能性。比如，通過微流控液滴技術，可將含有細胞的基質膠剪切成均一化的微球，研究人員利用該平臺成功培養了小鼠肝、肺、腎等正常組織的類器官，以及癌癥病人肺、腎、胃、直腸等多種腫瘤類器官。對樣品進行鑒定后證實了分化產生的樣品在形態與尺度上的均一性，且具有與源組織/腫瘤高度一致的細胞類型組成、組織病理學特性與基因表達特征，這些類器官在抗腫瘤藥物敏感性篩選實驗中也被證明具有較高的準確性。

上述研究表明，類器官模型的構建正在經歷不斷優化。相較于早期簡單類器官的構建，為了更好地模擬體內復雜的生理過程，工程化、模塊化的復雜類器官構建仍有較大的發展需求。結合器官微流控技術，類器官的體外構建已經開始走向了高通量、工程化的階段，細胞命運的體外時空精確調控得以實現，改進了類器官構建過程中高異質性、低效率的缺陷。

2.2 基因工程在類器官中的應用

細胞增殖分化產生不同組織、器官的過程不僅受外源的信號調控，也與內源性的基因表達程序高度相關。此外，許多疾病，尤其是腫瘤的產生過程，也普遍存在遺傳物質的改變與惡性突變的積累。伴隨著分子生物學相關技術的快速發展，尤其是基因編輯技術的發展，對基因進行靶向操縱的效率與準確性不斷提高，越來越多的研究開始針對類器官進行遺傳改造，從而探究人體器官發育調控機制，或解析腫瘤發生發展機制。

比如，Wnt信號通路是正常發育和腫瘤形成過程中的重要通路，而腺瘤性息肉病相關蛋白（adenomatous polyposis coli，APC）失活是Wnt信號通路中的重要事件。Liu等利用CRISPR的方法構建了APC敲除（APCKO）的類器官，成功復現了人體中Wnt通路異常激活情況下的腫瘤表型。除了直接改變Wnt信號通路的基因，也可以通過編輯其他基因以實現對Wnt通路的調控。采用CRISPR介導的基因編輯，Lin與Meltzer團隊在腫瘤類器官中發現了細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2A（cyclin dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A）和腫瘤抑制蛋白p53（tumor protein P53，TP53）的突變能夠抵抗Wnt異常激活而引起的細胞凋亡，揭示了腫瘤生成過程中的環境適應過程。

除了模擬體內存在的基因表達模式來重現體內分化或疾病產生外，對于體內環境中不存在但具有高度研究意義的基因，也可以通過基因編輯的方式整合進干細胞基因組中，并通過類器官模擬、跟蹤發育過程，拓寬對組織器官發育的理解。2021年，Alysson R. Muotri團隊使用基因編輯技術將古人類中剪接調控因子神經腫瘤腹側抗原1（neuro-oncological ventral antigen 1，NOVA1）突變型等位基因引入人類誘導多能性細胞，然后通過構建皮質類器官模擬腦發育，揭示了該突變位點在神經發育過程中的關鍵作用。研究發現，NOVA1突變體的表達會導致突觸蛋白相互作用網絡蛋白的變化，影響谷氨酸能信號，引發神經元連接的差異以及神經元電生理的異質性。該工作提出了NOVA1基因變異在現代人類背景下改變皮質發育的假設，為人類腦進化機制提供了線索。

2020年，Hans Clevers團隊開發了一種名為CRISPR-HOT（CRISPR-Cas9-mediated homology-independent organoid transgenesis）的工具，利用非同源依賴的CRISPR技術，可快速高效地對人源類器官進行基因敲入，并針對人源類器官中的特定基因進行熒光標記和可視化。這一技術為熒光敲入類器官引入了新方法，為研究組織器官中實時動態的細胞過程提供了高效的工具。此外，Jürgen Knoblich團隊以腦類器官為研究主體，建立了CRISPR-LIGHT技術，實現了在腦類器官中進行數百個基因的并行篩查，并將該方法應用于小頭畸形（microcephaly）研究中，確定了一系列與小頭畸形相關的基因。

總之，類器官中的基因編輯使研究人員能夠聚焦特定細胞類型、基因或信號調控通路，在類器官中重現正�；虍惓０l育過程，揭示疾病分子機制；同時，也可開發更多行之有效的類器官分析工具。通過基因編輯，不僅可以在體外實現類器官的疾病模型構建，也可以引入原系統中不存在的基因表達模式，在現有的基礎上改造、重建新的生物元件及系統，本質上與合成生物學中自上而下的設計思路有著高度相似性。

2.3 組織工程材料與類器官構建

在類器官構建過程中，除去外源性生化因素與物理因素對細胞命運的時空調控，以及內源性基因表達對分化方向的影響外，類器官的拓撲結構也是影響類器官分化結果的重要因素之一。一方面，目前用于在3D基質模型中培養類器官的方法，可能會導致組織隨機發育，類器官體積較大時，類器官內部細胞與外界環境的物質交換受到限制，難以從外界獲取充足的氧氣與營養物質，代謝廢物也難以得到有效排除。因此，類器官內部細胞易出現氧化應激、細胞死亡，限制了分化組織的大小與健康程度。體外培養的類器官一般也難以形成類似體內的血管網絡，無法克服上述障礙。另一方面，僅僅依賴自組織產生的類器官往往只具有較為單一的組織結構，在重現體內真實復雜的結構組成時具有一定的局限性。

為了解決上述問題，組織工程材料的添加或工程化支架的應用為類器官構建提供了一些新的思路。目前常用于類器官培養支架的材料包括重組蛛絲蛋白、脫細胞的胞外基質或3D打印的生物材料等。其中一部分作為支架材料直接添加進類器官培養中（如蛛絲蛋白等），為類器官形成與生長提供細胞附著生長的結構支持；另一部分則與類器官芯片制備技術相結合，為類器官提供具有特定的襯底拓撲結構或內部結構的支架，從而進一步實現特定微環境的構建與穩態維持。

2019年，Bortolomai等將3DⅠ型膠原支架與3% 1,4-丁二醇二縮水甘油醚（butanediol diglycidyl ether，BDDGE）交聯，再接種經過基因修飾的胸腺上皮細胞。胸腺類器官交聯支架的一側為排列整齊的多孔結構，類似于胸腺髓質；另一側為孔隙較少但更堅硬的纖維結構，類似于胸腺皮質。該膠原支架在高效完成物質交換的同時保證了良好的細胞透性和支架定植能力。2020年，Lutolf研究團隊開發了一種可以滲透氣體、營養物質和大分子的支架，可以誘導腸干細胞形成管狀上皮，在結構上，該管狀上皮具有可進入的內腔以及與體內相似的隱窩和絨毛狀組織形態；在功能上，該管狀上皮組織是可灌注的，從而可以連續去除管腔表面的死細胞，延長人工組織的培養時長。該模型保留了腸道的關鍵生理特征，并具有顯著的再生能力。而在2021年，通過3D打印技術結合生物材料，研究人員提出了一種工程方法，解決了腦類器官的核心區域易壞死、細胞分化誘導因子（如小分子或蛋白等）擴散受限等問題。在該研究中，通過使用聚己內酯支架對腦類器官進行培養，產生了經過改造的扁平化腦類器官，它具有良好的擴散條件，能更好地為其組織提供氧氣和營養，從而防止壞死組織核心的形成，有助于類器官在體外長期培養的維持。

上述研究主要為類器官的體外培養提供了特定的結構支撐及為氧氣、營養物質的擴散提供條件，除此之外，工程學支架的可調性質（包括生化成分與物理性質等）也可為類器官的體外培養提供精細可控條件。比如，不同的胞外基質剛度可以影響間充質細胞的分化方向，如較硬的基質（>30 kPa）促進成骨分化，而較軟的基質（<10 kPa）促進成脂分化。2022年，研究人員制備了一種基于脫細胞的牛和人子宮內膜衍生的水凝支架材料，體外構建了鼠和人的子宮內膜類器官。該研究中，作者探究了不同的洗滌劑對水凝膠進行處理，以及將水凝膠與不同組分交聯對于類器官分化的影響，證明了不同的組分、不同的工程化支架處理方式可影響類器官的細胞排列、結構乃至功能。

綜上，工程化的支架材料為類器官的構建提供了復雜的拓撲結構，有效促進了組織細胞與外界環境的物質交換，減少了類器官培養過程中細胞的氧化應激與機械損傷，一定程度上促進了類器官的分化成熟以及結構、功能上的穩定，有利于類器官的長期培養。不僅如此，工程化支架材料的可調性質，甚至可以在一定程度上直接影響類器官的分化方向和結構形成。此外，部分工程化支架結構引入了非天然的附著材料，在體外為特定組織結構提供了相應的支撐作用，以模擬體內的胞外微環境。結合3D打印技術及生物墨水，可使支架本身在結構、材料、力學特性以及穩定性上均符合工程學中程序化、模式化的特點。

2.4 融合類器官構建

體內真實的生理過程往往涉及多細胞類型、多組織、多系統的相互連接與相互作用，這使得在單一類器官構建之外，也需要在體外培養出具有更豐富的細胞類型、更完整的譜系來源、更復雜的互作結構的類器官。類器官融合培養即是針對該問題的探索。

2017年，研究人員在體外構建了人多能干細胞衍生而來的內側神經節隆起（medial ganglionic eminence，MGE）與皮質特異性的類器官，它們分別重現了體內MGE與皮質的發育過程。鈣成像結果顯示，培養的人內側神經節隆起類器官（hMGEO）和人皮質類器官（hCO）中產生了生理功能性神經元和神經元網絡，這也提示著二者的功能成熟。將hMGEO與hCO進行融合，研究人員發現中間神經元可向皮層側遷移，這一發現重現了體內中間神經元由MGE向皮質區切向遷移的過程。

融合類器官研究還體現在皮質-運動環路的體外構建中。2020年，Paşca團隊體外構建了類似于大腦皮質或脊髓/后腦的類器官，并與骨骼肌球體進行組裝，生成了皮質-運動組裝體。結合病毒追蹤、鈣成像及膜片鉗技術，研究人員對該組裝體進行了功能驗證，發現皮質神經元存在向脊髓的投射，脊髓源性的神經元與骨骼肌相連，對組裝體皮質端進行刺激可以誘發骨骼肌的強烈收縮。

以上研究都證實了不同的類器官可以實現體外組裝，從而建立類似于體內不同腦區、組織譜系之間的相互作用。這為在體外構建更復雜的類器官模型提供了依據，為理解發育和疾病的復雜過程提供了新思路與新方法。融合類器官相較于傳統的單一類器官，更接近于在體外進行人為的“系統”的構建。這一過程往往涉及不同種類類器官的分別分化、共培養與組裝，最終目的是在體外重現體內各組織分化、遷移與相互作用及形成完整功能結構的整體的過程。在構建融合類器官的過程中，研究人員將原本復雜的多組織共發育問題拆分為了更清晰的多種簡單類器官的分化、組裝問題，這與合成生物學中精確化、模塊化的策略相契合，通過這樣的方式，復雜的結構網絡被拆分為簡化的模塊，大大減少了系統構建過程中的隨機性。

2.5 類器官構建與生物傳感集成

在類器官的構建過程中，對類器官狀態的實時監控可以幫助研究人員更及時地觀測類器官的發育狀態，并根據實時反饋的結果及時優化與調整方案。該過程需要將類器官構建技術與生物傳感系統有效結合。2017年，Parker團隊通過多材料3D打印構建了一種心臟組織類器官芯片，該芯片整合了6種不同的功能性油墨，將生物傳感器導入培養系統中后，可以實現對層狀心臟組織自組裝過程的動態觀測。同年，研究人員將多功能的傳感器嵌入器官芯片，設計了一套完全集成的模塊化物理、生化和光學傳感平臺，利用此平臺，研究者在體外構建了人類肝臟和心臟類器官模型并進行了藥物篩選。類器官構建與生物傳感系統的整合，使得類器官的分化過程，以及分化過程中的即時狀態可以被完整記錄、分析、處理，幫助研究人員系統地給予反饋，該策略可更好地推動類器官培養向著模塊化、穩定化的方向發展。

綜上，研究人員在類器官構建的優化上已經進行了多方面的嘗試，類器官的構建在傳統模式的基礎上，逐漸開始產生了高通量、低可變性、高精確性等需求。因此，類器官的優化不僅需要在結構與功能上更接近體內真實狀態，也需要數字化、自動化、程序化、系統性的構建方案來實現對類器官誘導分化的精準調控、即時反饋與穩定分化。在這一過程中，類器官構建思路逐漸與合成生物學的研究思路產生了碰撞，其中，目前大多數優化方案都受到了合成生物學“自上而下”的研究思路啟發，通過對現有天然的生物材料、元件及系統進行人為的改造與優化，來實現高效、準確、穩定的類器官構建。而合成生物學“自下而上”的研究思路提出了人工生物系統的設計與構建，為類器官的優化提供了更大膽、更多元、更開放的研究思路與方向，或許將在未來推動類器官研究步入新的階段。

3 合成生物學在類器官中的應用

類器官的逐步發展和不斷創新的研究路線一定程度上體現了合成生物學中系統性、模塊化的思想與理念，而合成生物學的研究思路與不斷開發完善的工具也為更復雜的類器官系統構建提供了新的思路與靈感。

3.1 設計-構建-測試-學習研究循環

合成生物學相關研究以“設計-構建-測試-學習”（design-build-test-learn，DBTL）的研究循環作為核心路線[圖3(a)]。合成生物學一直在嘗試將工程原理引入生命科學，并推動生物元件的標準化和表征，以實現復雜生物元件、生物系統的可復制和可擴展構建。自動化、標準化與工程化地設計或改造生物元件，是合成生物學的初衷，而其中涉及的工程學思路與生命科學相結合的新模式，也為類器官構建方案的設計與優化提供了指導。

圖3 合成生物學研究路線(a)與常見的合成生物學工具(b)

其中，設計步驟依賴于充分表征的生物部件和計算機輔助方法。設計內容包括控制基因轉錄、翻譯的各類手段，基因表達的各類調控方法，以及各類翻譯后修飾手段的選擇與組合。構建步驟，各類先進的核酸工具酶試劑盒、各種核酸修飾技術以及各類組合式文庫數據簡化重組載體的構建過程，該步驟中可以實現組分到元件再到組件的逐步構建，直至組合成完整的具有功能的生物系統。測試步驟主要依賴于微流控芯片及高通量篩選，監測系統輸出，如熒光蛋白標記；用于化合物檢測的液相色譜-質譜（LC-MS）分析技術等，測試所構建的生物元件是否穩定、可重復且具有相應的功能。在學習步驟中，采用各種計算機建模方法進行深度學習并對設計及構建過程進行仿真和優化。

這一研究循環在類器官的構建過程中也有一定的體現，在新的類器官構建方案的開發早期，研究人員需要明確所需構建的類器官模型的體內發育過程，包括發育的中間狀態及分化各階段的分子機制；基于明確的生物過程，研究人員需要設計合適的類器官體外培養條件，實現具有特定細胞類型及特定結構的類器官體外分化誘導；在得到初步的模型后，需要對樣品進行形態學觀察、免疫熒光染色、單細胞測序等，驗證類器官的細胞組成、形態結構以及與體內組織的相似性；基于驗證的結果，研究人員需要進一步優化培養條件直至獲得最優、最穩定的培養方案。在類器官構建方案的開發中，這一循環往往需要面對漫長的時間和繁復的人工操作，而合成生物學結合計算機輔助及深度學習，可以大大提高測試與學習的進程，指導類器官模型構建步入工程化、高效化的階段。

3.2 合成生物學工具

近年來，多種合成生物學工具被應用于生命科學研究中，這些工具的開發與完善，在類器官的研究中也展現了廣闊的發展前景[圖3(b)]。本小節將聚焦于現有及新興的合成生物學工具的原理及其在類器官構建與優化過程中的應用與發展潛力。

3.2.1 光遺傳學工具

利用光遺傳學原理，可以設計基于光控開關的調控系統。由于光照控制的靈活性，可使刺激具有較高的空間和時間精度，因此光遺傳方法比傳統的藥物操作具有明顯優勢。目前，光遺傳學工具在類器官的構建中已有了廣泛的應用。Repina等利用光遺傳學技術，在胚胎干細胞中激活Wnt/β-catenin信號通路，誘導了細胞的分化、遷移與分選。研究人員也可利用光遺傳技術在神經類器官中局部激活SHH信號。結合高分辨率空間轉錄組學和單細胞分析技術，研究人員發現這種局部誘導足以生成具備空間組織模式的類器官，并提出將光遺傳學擾動與空間轉錄組學結合起來，重新編程并研究類器官中的不同細胞的命運和組織模式的策略。

3.2.2 工程化的細胞近/遠程通信調控

在發育過程中，細胞間相互交流與細胞的分化及形態發生相關，而可擴散的形態發生因子及其梯度差異可以誘導特定細胞類型以不同空間順序分化，這些信號及其受體共同構成了細胞近/遠程通信網絡。利用合成生物學，在體外構建短程或遠程的信號轉導，可以實現類器官構建過程中所需的細胞-細胞、細胞-基質之間互作以及形態因子在濃度、梯度上的精確、可控的調控。

細胞表面受體作為通信網絡中不可或缺的一環，使細胞能夠檢測、處理和響應胞外微環境的信息。近年來，合成生物學家基于天然受體的物理部件與概念進行了合成受體的設計，使得細胞與細胞、細胞與胞外環境間信號的感知-響應過程可以被用戶定制。其中，在天然系統中，Notch信號通路是決定細胞命運的重要通路之一，相鄰細胞通過Notch受體傳遞信號可以調節細胞的分化、增殖和凋亡�；�于Notch信號通路，合成生物學家合成了SynNotch系統，在該系統中，表達SynNotch受體的細胞識別呈遞用戶定義抗原的發送細胞，通過釋放經工程改造的轉錄因子，誘導定制的轉錄調控。該合成的SynNorch系統，可以應用于類器官構建過程中，一方面作為細胞-細胞作用的報告基因在3D組織中監測細胞互作，另一方面可以定制特定的轉錄調控模式，誘導特定的形態發生因子及受體產生。目前，已經有研究通過體外構建帶有SynNotch的小鼠多能干細胞系，在2D的細胞培養及3D的小鼠嵌合胚胎培養中，成功識別了細胞與細胞的相互作用，并通過SynNotch激活神經元分化因子neurogenin 1，當這些受體細胞與發送細胞接觸時，兩者之間形成的邊界成功誘導了神經元分化。

在SynNotch系統的基礎上，Lim團隊構建了可以識別GFP并進行反應的工程化受體，并將編碼這些受體的基因插入細胞，這些細胞與SynNotch系統結合后，構成了可識別擴散的信號分子的系統。基于該系統，可以在類器官構建過程中，實現用戶定義的細胞的遠程信號轉導，識別可擴散的形態發生因子及相應的濃度梯度并進行響應，使得細胞轉錄調控及非對稱性的形態發生在更為可控的條件下進行。

3.2.3 工程化細胞黏附分子

差異黏附假說認為，發育過程中液態組織的擴散和細胞的分離現象源于組織表面張力，而組織表面張力源于細胞間黏附性的差異。細胞間黏附性的差異源于內源性的黏附分子表達水平與鈣黏蛋白類型的差異，這將最終影響細胞的形態發生以及細胞的自組裝。目前，合成生物學工具已經實現了對細胞進行設計或重構，從而影響其內源性黏附分子的水平和類型，以實現對類器官培養過程中3D結構的自組裝過程的間接調控。

2023年，Lim團隊通過將正交的細胞外相互作用與天然黏附分子（如鈣黏蛋白和整合素）的細胞內結構域相結合，生成了多種合成的細胞黏附分子（synCAMs）。由此產生的分子產生了與天然相互作用相似的黏附特性的定制細胞-細胞相互作用。synCAMs胞內結構域的確定主導了界面形態和力學，而不同的同型或異型胞外相互作用結構域獨立地確定了細胞間的連接。這種合成的正交黏附分子工具能夠合理地程序化組裝獨特的多細胞結構，以及實現自然組織的系統性重塑。基于此工具，類器官構建過程中復雜且相對隨機的細胞自組裝過程能夠得到程序化的定義，充分降低類器官構建的異質性，也為類器官構建過程中細胞類型及細胞互作的確定提供了有效的保障。

3.2.4 合成基因與工程化細胞命運調控

細胞增殖、凋亡、遷移、分化是干細胞向更穩定、具有更細化功能、更龐大的細胞群體過渡的基本過程，在發育過程中，控制細胞群體的大小（包括細胞數量和細胞類型比例）對于組織器官的形成及穩定尤為重要。2023年，研究人員在哺乳動物細胞中設計并合成了一種系統，該系統可以在哺乳動物細胞中實現生長素的產生與對生長素的響應，并將其與控制細胞增殖與凋亡的基因相聯系，從而實現細胞種群密度的調控。該方案的實現使得細胞在體外培養過程中的數量及不同類型細胞比例能夠處于自發的、設計好的程序控制下，這在類器官構建過程中十分必要。

對于細胞分化過程的發生，經典表述認為細胞的基因功能以及它們形成的復雜調控網絡在時空上控制了基因的表達量，從而編程了細胞命運決定（fate determination）的過程。2023年，有研究根據定量實驗和數理模型，通過基因撥動開關，探索細胞生長速率對經典人工合成基因線路-互抑制回路的雙穩態性的影響，發現了不同基因的表達量對生長速率呈現不平衡、不同步的響應，進而重塑細胞命運決定景觀。基于不同的合成生物學基因線路，可以在體外實現對不同基因的表達調控，這使得針對類器官的細胞命運決定篩選有了相應的工具支持，當需要對細胞命運進行程序化調控時，不同基因線路的排列組合可以使得細胞命運置于工程化控制之下�？傊�，合成生物學能支持工程化的命運控制，在類器官中精確調控細胞的增殖、分化、凋亡等與細胞命運決定高度相關的事件，將復雜的組織生成過程拆分成更小的模塊，實現精準調控。

與傳統的類器官構建的模式相比，合成生物學工具能以更可控的方式，從細胞命運決定、細胞通信、細胞自組織、細胞基因表達等多個方面對類器官的建立進行調控，從而形成與人體組織器官更相似的類器官模型。合成生物學工具也為理解器官組織形態、信號轉導以及更好地設計類器官培養方案等提供了新方法。

4 類器官對合成生物學的推動

自21世紀初至今，合成生物學已經經歷了20多年高速發展的階段，新興的合成生物學工具的產生與相關合成生物學方法的構建使得合成生物學的應用方向越來越廣泛，包括細胞治療、藥物生產、生物材料合成等。但當下合成生物學的發展也面臨著一定的挑戰。伴隨著類器官技術的不斷發展，以類器官作為平臺，目前已建立了多種系統性工具，以用于實現對組織器官發育、疾病發生發展、不同組織類型的細胞多樣性、遺傳信息變化等方面的分析。類器官在實現體內組織器官的細胞類型與結構重現的同時，具有與在體組織相比更易獲得的優勢，這使得依托類器官可進行高通量的篩選。系統性研究方法的應用，可以使得研究人員對發育或疾病發生進程有更全面精確的理解，也對合成生物學研究中系統性、模塊化、高精確性地設計生物學元件提供了基礎。本節將闡述合成生物學發展過程中面臨的挑戰與困難，并探討類器官及其衍生技術的發展對合成生物學研究的促進與推動作用。

4.1 合成生物學發展面臨的挑戰

當下，合成生物學仍然面臨諸多挑戰。比如，合成生物學的設計過程需要對天然生物元件及其相互作用，包括信號通路的激活、轉導以及下游相應的過程有著全面且系統的把握，除此之外還需要大規模數據庫的支撐。但目前在真實的生物體中，仍然有大量的生物元件其功能、結構以及互作模式尚未明確，且存在體內樣本取樣難、數量少的問題。同時，合成生物學工具在改造現有系統之外，還涉及定制和動態合成基因組，這一過程高度依賴從組學實驗中獲得的全細胞模擬與深度學習，這對數據庫有了更高的需求。此外，合成生物學工具需要大規模的平臺進行學習與測試，這需要高通量、可控制的載體作為基礎。因此，類器官模型作為可以在體外高效模擬體內微環境的工具，可以提高合成生物學工具測試、學習、重構過程的效率及準確性�；�于類器官模型衍生的組學研究及高通量的篩選，也可以使得合成生物學家能更好地把握天然生物系統中的分子機制與相應的生物學過程。

4.2 類器官轉錄圖譜

如何評估類器官的質量，是類器官構建中的基本問題之一。除了理解類器官的體外分化效率、異質性外，類器官與體內組織器官的相似度如何是類器官質量控制的關鍵內容。相對于傳統的形態觀察、切片染色方法，高通量的單細胞測序技術可以實現對單個細胞進行遺傳物質的分析。從細胞類型和基因表達模式上對類器官與體內組織進行更精準的比較分析，可更直觀地研判二者的一致性。同時，研究人員也可以根據二者細胞類型和基因表達差異來對類器官構建方法進行改進。2015年，Treutlein團隊將單細胞測序技術與類器官構建結合，對腦類器官與胎兒新皮質的細胞組成以及祖細胞至神經元之間的譜系關系進行了分析比較，發現在他們所培養的腦類器官中，皮質細胞通過與胎兒組織高度相似的基因表達程序組織成大腦皮質樣區域。這為在腦類器官培養中研究人類皮質發育的遺傳特征提供了理論依據。

類似的工具還應用于驗證類器官的不同發育階段與體內組織器官不同發育階段的一致性上。2022年9月，Paola Arlotta團隊對培養23天到6個月共8個不同發育階段的皮質類器官進行了轉錄組、表觀組和空間轉錄組等多個水平的單細胞測序，通過對結果進行分析，揭示了皮質類器官發育過程中的細胞多樣性以及其與腦發育的一致性，且這種一致性不受代謝狀態的影響。這也證實了人腦類器官在研究人腦發育和細胞命運決定中的重要作用。基于不同發育時間點的類器官轉錄組數據，也讓研究人員更好地理解器官發育過程中的細胞類型發生與基因表達調控變化。

2023年，Paşca實驗室為了更系統地理解形態發生素在神經系統發育以及神經類器官體外分化培養過程中發揮的作用，建立了人類神經細胞命運規范的形態發生圖譜，為類器官體外誘導分化培養的條件選擇提供了一定的指導。同年，He Zhisong等整合了現有的26個方案的36個單細胞轉錄組數據，收集到了一個超過170萬細胞的完整的人類神經類器官細胞圖譜，該圖譜有助于評估神經類器官的保真度，表征受干擾和患病狀態，并促進未來分化方案的制定。

隨著越來越完善的單細胞測序方法和越來越多的類器官單細胞轉錄組數據的產生，人們可以系統地認識特定類器官或類細胞群體在發育過程中的調控，理解同一類型類器官不同分化方案產生的樣本之間的異同。因此，這些探索有助于全面理解器官發育、疾病發生，為以后系統性、程序化的類器官培養體系的設計提供理論基礎。利用類器官樣本與體內組織相比更易獲得的優勢，尤其如腦組織等可及性低的體內組織，基于類器官的轉錄圖譜的構建，合成生物學研究者也可以便利地研究組織器官發育、不同信號通路以及疾病發生發展過程中相關的基因功能，從而更好地設計生物元件、系統以及相關的合成生物學工具。

4.3 類器官CRISPR篩選

CRISPR篩選是認識基因功能的有力工具。隨著體外高通量培養類器官方法的完善，以類器官為平臺的CRISPR篩選在研究器官發育、疾病發生、組織再生等方面都展現出了顯著優勢。

2022年，基于6個轉錄因子的可誘導表達，研究人員建立了一個高效的小膠質細胞樣細胞分化方案。研究人員在該系統中建立了可誘導的CRISPR干擾和激活，并針對“可靶向基因組”進行了3次篩選。這些篩選的結果揭示了控制小膠質細胞存活、活化和吞噬功能的基因，從而有助于實現對小膠質細胞的功能表征和治療靶向。在此之前的研究中，Pașca團隊建立了皮質類器官與類似皮質下結構的類器官，將二者融合培養建立了類器官組裝體，模擬了前腦中間神經元的切向遷移過程。2023年，基于該組裝體模型，研究人員以425個孤獨癥障礙譜系以及其他神經發育障礙疾病的相關基因作為候選進行了CRISPR篩選，發現了13個影響中間神經元分化的基因，以及33個影響中間神經元遷移的基因。

目前，結合類器官的CRISPR篩選填補了體內部分組織細胞難以獲取的局限性，使得一些可及性較差的組織的發育過程能在體外得到重現，同時針對疾病模型或相應藥物靶點進行篩選，也為許多藥物的開發提供了與體內組織高度一致的臨床前模型，有助于疾病發生發展機制與疾病相關藥物靶點的探索。這些實踐也有助于合成生物學研究者更好地了解疾病模型，把握與疾病發生發展以及藥物作用相關的機制，促進合成生物學工具在臨床上的研發與應用。

總結與展望

本文概述了類器官及合成生物學的發展過程，并探討了傳統類器官構建及優化過程中體現的合成生物學策略，以及合成生物學工具在類器官優化及類器官功能擴充中的作用。在類器官與合成生物學協同發展中，值得關注的代表性方向包括利用類器官模型促進生物元件設計。比如，類器官衍生的組學圖譜構建以及高通量CRISPR篩選，可為合成生物學的設計與構建提供更便利、全面、完善的數據基礎，使得合成生物學研究人員能夠更快、更容易地把握相應的生物學過程，探索可合成的生物元件。又如，合成生物學面臨的一個重大挑戰是設計細胞的分化和特化，以便在合成多細胞系統中進行有效和富有成果的分工。到目前為止，合成生物學主要集中在通過單一任務設計的種群中的每個細胞上。而類器官與合成生物學的結合有望在未來實現具有特定功能的合成器官的體外構建，能夠在體外精確、可調控地構建特定的組織與器官并實現相應的功能。

對類器官模型的體外構建而言，目前也存在一定的技術限制，比如煩瑣的人工操作、較高的個體間與批次間差異、部分類型的類器官需要較長的培養時間等。尤其是針對結構或譜系組成復雜的類器官的構建，該過程高度依賴于對培養環境以及細胞命運的精準調控。如何在類器官構建中借力合成生物學原理與技術，是值得關注的發展方向。以目前常用的動物來源的基質膠使用為例，該材料存在批次間差異，且無法完全還原體內正常組織的結構，因此成為類器官優化構建的瓶頸之一。結合合成生物學相關元件目前已經可以實現基因的可編程性調控，但在胞外環境的重構方面仍需要進一步優化和探索。比如，具有DNA編碼特性的材料已經有了一定的研究，可基于此在體外高效生產工程化的生物材料，或許可在未來為類器官構建時的胞外環境需求提供潛在解決方案。

總之，在過去十多年，作為體內組織器官在體外的3D微縮模型，類器官技術已得到廣泛應用。將類器官技術與合成生物學相結合，可以彌補構建類器官過程中存在的一些限制。基于類器官模型的多種合成生物技術或原理的整合，也為合成生物學在體外精準操控生物元件的合成與重構等方面提供了有效的實踐平臺。在發展的過程中，類器官與合成生物學兩者相輔相成，其協同發展將有望為今后研究人體器官、組織提供更優的生理相關模型，也有望進一步促進合成生物學工具的開發與實踐。