熒光偏振成像通過測量樣品中熒光分子的偏振狀態，得到樣品的取向結構特征，在生物學領域有著廣泛的應用。偏振成像常與其他熒光顯微技術結合，用來解析細胞結構的排列方向、生物大分子的實時動態取向和組織的有序性等信息，以研究細胞的生理過程、藥物對細胞的作用及異常結構的檢測。

北京大學生物醫學工程系的楊子儀團隊發表文章，闡述了熒光偏振成像在生物學等領域的應用，對利用偏振信息獲取不同樣品取向結構的研究方法進行分析比較，并對其未來發展趨勢進行展望。

熒光偏振成像技術原理
熒光偏振成像在生物學研究中具有重要意義，它通過測量樣品內熒光分子的偏振狀態，進而獲取樣品的取向結構特征。

熒光具有強度、波長、時間和偏振這四種特性，其中偏振方向與電場矢量方向一致。當用線偏振光激發熒光偶極子時，光子的吸收概率與激發光場和偶極子方向夾角的余弦平方成正比；最終探測概率也與輻射光場方向和探測器方向夾角的余弦平方成正比。因此，通過對發射光場方向和強度的探測，能夠推斷出熒光偶極子的角度取向，從而進一步研究樣品結構特性，并且由于成像速度較快，該技術可用于活細胞樣本的實時取向和動態結構分析。

主要的熒光偏振成像技術包括熒光各向異性（FA）、線性二向色性（LD）和散焦成像。這些技術能夠對樣品進行單分子或寬場成像觀測。單分子成像可獲取特定分子的取向和擺角，寬場成像則能得到一定區域內多個探針的平均取向和平均擺角。

例如，熒光各向異性成像常采用圓偏振激發光，在探測光路中利用偏振分光棱鏡將發射熒光分解為不同方向，通過特定公式計算得到偶極子的取向特征；

線性二向色性成像利用偏振調制器產生不同方向的線偏振激發光，記錄熒光強度與激發光偏振態關系以獲取樣品取向信息；

散焦成像通過調節焦平面位置，根據物體散焦成像的雙瓣狀特征判斷偶極子取向，但該方法成像結果較模糊，對成像系統信噪比要求較高。

此外，熒光偏振技術還可與共聚焦、結構光照明顯微等多種顯微技術相結合，在生物樣本成像時，需綜合考慮時間和空間分辨率等因素，權衡不同技術性能以滿足生物學問題的成像需求。

在生物學各領域的應用

一、馬達蛋白研究
馬達蛋白包含動力蛋白、驅動蛋白和肌球蛋白，在細胞內利用ATP水解能量沿微管或肌動蛋白絲進行機械運動，參與物質運輸、有絲分裂等重要生物學動態過程。

熒光偏振成像在研究馬達蛋白動態方位角等性質方面發揮關鍵作用，有助于建立馬達蛋白步進模型，對探究人體生命活動和馬達蛋白異常相關疾病意義重大。

例如，Goldman課題組在2017年運用熒光偏振全內反射顯微技術（polTIRF），將量子納米棒連接在動力蛋白多肽部分環結構上進行成像，測量其在微管步進時環結構的位置與3D方位角變化，發現平均角度變化約為8°，與步長大小弱相關、與ATP濃度無關，進而提出基于桿的彎曲和鉸接的新動力學模型。

對于驅動蛋白，Moerner課題組在2001年比較不同熒光探針標記效果并利用線性二色性熒光偏振顯微鏡研究其沿微管的取向性；Goldstein課題組同年運用熒光偏振技術測量驅動蛋白在不同核苷酸狀態下的熒光偏振比，推斷其取向靈活性并提出能量供應下的步進模型；Sosa課題組在2003年將研究推廣至二聚體，標記驅動蛋白二聚體研究ATP水解過程中兩個馬達結構域的取向和相對構型，2009年又對ATP等待狀態下的驅動蛋白進行標記和偏振成像，補充了能量供應下的驅動蛋白步進模型。

在肌球蛋白研究方面，Selvin課題組于2006年通過聚焦和散焦成像測量肌球蛋白V分子的3D取向和步進行為；Goldman課題組在2007年運用polTIRF技術研究肌球蛋白步進時與肌動蛋白絲的三維旋轉角度關系，發現其運動區域和杠桿臂間存在柔性區域；2008年該課題組又用羅丹明標記肌動蛋白絲，測量肌球蛋白II和V步進時肌動蛋白絲繞軸旋轉的方位角變化，探討其旋轉機制；2012年Yanagida課題組用高熒光量子棒標記肌球蛋白 V，研究其沿肌動蛋白絲運動與繞自身軸旋轉角度關系，得出每步進一次繞自身軸旋轉約90°的結論；2013年Goldman課題組利用時間相關的單光子計數技術，以高時間分辨率的polTIRF顯微鏡更精確地研究肌球蛋白的擺動特征。

二、細胞膜研究
膜結構及動態變化
生物膜作為磷脂雙分子層，包含膽固醇和多種蛋白質，其結構對物質運輸、信息交換和細胞內環境穩態等生命過程至關重要。熒光偏振可通過探針取向各向異性等參數反映膜結構形態及信號傳導變化，為深入理解生物學機理提供依據。

眾多技術手段被應用于該領域研究。2003年，Piston課題組使用標記GFP的MHC蛋白，通過激光掃描顯微鏡測量計算穩態各向異性，確定GFP和MHC單邊剛性連接位置，并研究MCMV肽片段裝載對各向異性的影響，為后續相關研究奠定基礎。

2004年，Almers課題組運用全內反射顯微鏡，以正交方向偏振光激發樣品觀測熒光強度，根據s和p激發下的熒光強度變化研究染料在質膜中的擴散，輔助探究胞吐過程中的膜融合。

2010年，Anantharam課題組以di標記質膜，采用偏振全內反射熒光顯微鏡進行高時空分辨率成像，觀察質膜胞吐與內吞時偏振參數的改變，研究質膜拓撲形態變化及相關蛋白在胞吐中的作用。

2011年，Brasselet課題組利用共聚焦熒光偏振顯微成像技術，用GFP和di-8-ANEPPQ標記細胞膜蛋白MHCI和脂質，加入改變細胞骨架結構的藥物，通過測量藥物作用前后的偏振度推測擺角范圍變化，研究細胞骨架對細胞膜形態的作用。

2013年，Brasselet課題組在前期研究基礎上，利用傅里葉分析開發高精度共聚焦顯微技術，以不同親脂性探針標記脂質膜，研究膜拓撲結構在細胞骨架受影響和膽固醇消耗時的變化。

2022年，Lew課題組將偏振調制和光瞳分離技術結合，開發出高分辨率顯微技術，以尼羅河紅為探針標記脂質膜，通過不同通道強度反映偶極子相關信息，高精度研究膜的形態結構及流動性。

雙光子熒光偏振技術也廣泛應用于膜結構研究，如2005年French課題組用標記在膜不同方向的探針，運用雙光子熒光偏振顯微鏡研究膜納米管結構及膽固醇消耗對膜結構的影響；2009年Onfelt課題組使用雙光子顯微鏡，通過歸一化偏振參數反映探針有序性，測量自然殺傷細胞形成免疫突觸期間的偏振參數，研究其細胞膜褶皺程度；2011年Lazar課題組運用具有較高線性二色性的雙光子熒光偏振顯微技術觀察膜結構，研究G蛋白與其受體作用及鈣離子濃度引起的鈣傳感器構象變化；2014 年Brasselet課題組運用可調線性二色性的雙光子熒光偏振顯微鏡，開發數據分析方法，獲取細胞膜上探針更精確的取向分布。

散焦成像技術同樣在膜結構研究中有應用，2008年Dunn課題組通過散焦成像測量熒光脂質類似物在DPPC薄膜中的取向，發現其傾斜方向對表面壓力的不同影響及膽固醇對脂膜有序性的作用；2013年Dunn課題組揭示GM1對脂膜特性的顯著影響，如添加微量GM1會導致脂膜膨脹。

膜相變化
隨著對膜結構認識的深入，膜的流動鑲嵌模型逐漸發展為更復雜的多相系統模型。熒光偏振可用于測量膜的總體取向，分析不同液相結構的有序性。

例如，2001年Baird課題組用脂質探針標記膜結構，測量不同膽固醇濃度下的熒光各向異性，研究膽固醇對脂質有序性的作用及脂質筏在細胞膜中的存在比例。2008年Marques課題組采用雙光子熒光偏振結合熒光壽命顯微技術，用特定探針標記不同膜相構成的囊泡，測量探針熒光強度隨囊泡輪廓角度的變化，建立不同相中探針取向勢能模型。2009年Yip課題組運用熒光偏振全內反射顯微鏡和原子力顯微鏡聯合成像，用多種探針標記膜結構，研究加入物質后膜相區域分布及分子有序性變化，探究膜破裂機制。2020年Lew課題組將單分子取向定位顯微鏡用于膜相分析，通過探針擺角取向范圍區分不同膜相，并測量酶對膜相的改變，且該技術相比SMLM成像具有不受探針與膜結合時間影響和更高對比度的優勢。

三、DNA研究
DNA作為人體主要遺傳物質，其構象特征對基因表達調控有重要作用，除常見雙螺旋結構外，還存在其他構型。熒光偏振可用于測量DNA鏈的結構取向，對藥物設計極具價值。

2009年，汪海林課題組應用熒光偏振，通過正交偏振方向熒光強度相減去除未標記熒光染料影響，檢測基因組甲基化水平。2016年，Moerner課題組以類似PAINT方法用λ噬菌體DNA進行體外研究，獲得高分辨率偏振圖像，明確SYTOX染料相對于非插層染料的標記模式，探究DNA鏈構象。

2019年，席鵬課題組開發偏振結構光照明顯微（pSIM）技術提高偏振成像分辨率，用SYTOX垂直插入標記DNA，清晰測量DNA細絲取向。2019年，Peterman課題組采用花青素嵌入劑標記DNA，結合寬場熒光偏振顯微鏡和光鑷技術，測量DNA鏈受拉伸時的偏振參數，通過建模擬合分析不同階段分子平均取向和擺角半徑，為S-DNA形成提供證據；2021年該課題組進一步觀察過度拉伸DNA的結構特征，證實P-DNA主要在富含A-T堿基對序列中形成，證明熒光偏振顯微鏡和DNA力譜相結合是研究過度拉伸DNA納米級結構特征的有力手段。

四、細胞骨架研究
細胞骨架是真核細胞維持形態的重要結構，由微管、微絲、中間纖維和Septin等組成，熒光偏振顯微技術為觀察其結構及動力學變化提供新途徑。

Septin：在釀酒酵母芽殖過程中，其結構動態變化備受關注。2006年，Vrabioiu和Mitchison使用septin-GFP融合體基因取代內源性基因，利用熒光偏振顯微鏡觀察到從沙漏到環狀轉變時，septin細絲在膜平面旋轉90°且整體形態構成圓周。2011年，DeMay課題組開創LC-PolScope技術，分析septin-GFP在酵母出芽過程中的取向變化，證實其高度組織化且與芽頸關系密切，明確芽殖酵母頸部區域septin-GFP的結構動力學。2015年，Abrahamsson課題組用多焦點偏振顯微鏡同時收集三維空間信息，分析胞質分裂時septin的重新排布，且可長時間成像酵母細胞。2016年，Mehta課題組使用瞬時熒光偏振顯微鏡，以單分子靈敏度和100ms時間分辨率成像活細胞中熒光團，追蹤septin-conGFP顆粒位置和取向，確定其動力學特征。

微絲：由肌動蛋白螺旋狀聚合而成，在細胞活動中作用顯著。2016年，Brasselet組利用偏振分辨直接隨機光學重建顯微鏡研究固定細胞中的肌動蛋白應力纖維，發現不同染料標記下與纖維方向的關系，證明該技術可作為定量指標觀察細胞形狀變化中肌動蛋白絲重組。同年，Mehta課題組使用瞬時熒光偏振顯微鏡和跟蹤算法，分析活細胞中肌動蛋白網絡結構動力學和肌動蛋白絲分子取向。2019年，高軍濤課題組采用基于組稀疏性的超分辨偶極子定向映射方法，發現肌動蛋白細絲中熒光分子偶極取向與細絲方向關系及在交叉處的三維共定位。2023年，席鵬課題組開發高速自偏振同步調制三維結構光照明顯微鏡，利用相關技術優勢，準確分辨肌動蛋白絲取向分布。

微管：由微管蛋白和微管結合蛋白組成，結構特性重要。2014年，Walla課題組使用偏振解調超分辨技術和激發偏振角縮窄技術，觀察固定PtK2細胞中微管纖維細節，反映微管周圍螺旋結構。2019年，席鵬課題組利用偏振光結構光顯微技術對活U2OS細胞中微管成像，成功觀測偶極子方向動態變化，證實該技術可用于活細胞成像且分辨率優勢明顯。

其他應用領域

核孔復合物
核孔復合物是嵌入核膜孔隙的大型蛋白通道，介導核質運輸。晶體學和單粒子電子顯微鏡雖能獲取部分核孔蛋白高分辨率結構，但無法解決其排列等問題。2010年，Mattheyses課題組利用大分子復合體對稱性和組織結構，開創熒光各向異性方法，用GFP標記核孔蛋白，觀察活酵母中蛋白質結構域有序或無序狀態，揭示個別蛋白質結構域物理排列信息及核孔結構動態變化，明確剛性和柔性結構域特征。2011年，Kampmann課題組提出用偏振熒光顯微鏡研究活酵母和哺乳動物細胞中核孔蛋白方向的方法，結果符合公認模型。

海馬神經元
其結構精細，研究其結構有助于理解神經系統功能。2014年，Hafi課題組使用偏振解調超分辨和激發偏振角縮窄技術，對海馬神經元棘成像，實現寬視場成像且穿透深度優于基于TIRF的方法，雙光子激發時穿透深度更大。2016年，席鵬課題組將稀疏反卷積和最小二乘估計應用于熒光偏振調制數據，發現海馬神經元樹突棘頸偶極子取向非均勻分布，表明可能存在雙膜結構且頸部兩側熒光分子取向形態有差異。2022年，清華大學高軍濤課題組使用光學鎖定檢測超分辨偶極子定向映射技術，觀察到活體神經元樹突棘擴張和收縮的各向異性變化，揭示其形態和方向動態，推動突觸活動研究。

巨噬細胞
在機體生理過程中作用關鍵，與多種疾病相關。2018年，席鵬課題組通過散焦分析確認SERS納米棒的各向異性效應，在巨噬細胞中用其標記囊泡，實現亞衍射分辨率成像，動態跟蹤記錄軌跡和方向信息，揭示亞細胞器超微結構。

細胞力
對生物過程不可或缺，獲取細胞力信息有助于理解生命活動機制。2018年，Salaita課題組利用分子張力探針和熒光偏振顯微鏡測量小鼠成纖維細胞和人血小板中細胞力大小和3D方向，繪制牽引力方向，發現血小板受力結構與受力方向一致性及凝塊結構和力學特征的各向異性和空間異質性。

聚合物動力學
聚合物行為復雜，其物理性質和動力學機制有待深入理解。散焦成像可同時觀察眾多分子，為研究聚合物分子旋轉擴散提供可能。2004年，Enderlein課題組通過散焦寬場成像探測單個分子發射模式變化，為相關跳躍模型提供證據。2006年，該課題組跟蹤分子在玻璃聚合物薄膜中的3D旋轉擴散，觀察到多組分旋轉擴散衰減，反映聚合物不同弛豫狀態和局部環境快速變化。

纖維素酶
提升其酶效率對生物燃料生產意義重大，研究其與底物相互作用及動力學機制有助于優化生物燃料生產。2011年，Smith課題組通過單分子熒光散焦成像，觀察到單個碳水化合物結合塊與結晶纖維素在水環境中的位點特異性結合，明確結合方向，為結合機制提供原位物理證據。

結論與展望
熒光偏振顯微成像技術利用熒光分子偶極取向信息研究生物結構，能揭示分子取向，提供比傳統熒光成像更多信息，在解析復雜生物大分子結構和還原生命活動動態過程方面應用廣泛，且可與多種成像模式結合，為超分辨熒光成像提供思路和幫助，如開創超分辨熒光偏振顯微技術，提供高分辨率和詳細取向信息的成像結果。

展望未來，該技術有望進一步發展。自適應光學可校正像差，在3D偶極子信息提取或深層組織矢量成像中發揮重要作用；無標記偏振顯微鏡可與熒光偏振顯微技術互補，獲取更多微觀結構信息；光電關聯顯微技術結合多種技術優點，可提供高分辨率細胞環境特定事件成像，熒光偏振顯微技術與之結合有望提升成像效果；與電子顯微鏡結合可為生物學家提供更有效的研究工具；同時，該技術在分辨率和偏振信息分析能力方面將不斷優化，在生物學領域發揮更廣泛有效的應用。

聲明：本文僅用作學術目的。文章來源于：楊子儀,李世晗,劉芷如,鐘素藝,李美琪,席鵬.熒光偏振成像技術及其生物學應用[J].激光與光電子學進展,2024, 61(18):1800001.Ziyi Yang,Shihan Li,Zhiru Liu,Suyi Zhong,Meiqi Li,Peng Xi.Biological Applications of Fluorescence Polarization Imaging[J].Laser & Optoelectronics Progress,2024,61(18): 1800001.