蔗糖酶試劑盒實(shí)驗(yàn)分光光度法測定詳解
正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定。
測定意義：
蔗糖酶（sucrase）（EC 3.2.1.26）是碳水化合物消化吸收的關(guān)鍵酶之一，能夠水解蔗糖變成相應(yīng)的單糖而被機(jī)體吸收。
測定原理：
本試劑盒采用3.5－二硝基水楊酸法測定蔗糖酶催化產(chǎn)生的還原糖的含量，由此可得出蔗糖酶水解速度。其原理是3.5－二硝基水楊酸與還原糖共熱被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)還原糖的量和反應(yīng)液的顏色深度成正比。此法操作簡便、迅速、雜質(zhì)干擾較小。
所需的儀器和用品：
可見分光光度計(jì)、沸水浴、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
提取液：液體60mL×1瓶，4℃保存；
試劑一：液體2.5mL×1瓶，4℃保存；
試劑二：粉劑×1支 ，4℃保存，用時加入1.5mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑4℃保存；
試劑三：液體5mL×1瓶，常溫保存；
樣品測定的準(zhǔn)備：
按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
加樣表和測定步驟：
置于25℃準(zhǔn)確水浴10min
混勻， 95℃水浴5min左右（蓋緊，防止水分散失），冷卻至室溫
混勻，520nm蒸餾水調(diào)零，測定各管吸光值，ΔA=A測定-A對照，每個測定管設(shè)一個對照管。
蔗糖酶活力計(jì)算：
1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y = 0.1296x -0.12；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/mL），y為吸光值。
2、按照蛋白濃度計(jì)算
單位定義：每mg組織蛋白每分鐘催化水解1μg蔗糖定義為一個酶活力單位。
蔗糖酶活力(μg/min/mg prot)=[1000×(ΔA+0.12)÷0.1296×V1]÷(V1×Cpr)÷T=771×(ΔA +0.12)÷Cpr。
3、按樣本鮮重計(jì)算
單位定義：每g組織每分鐘催化水解1μg蔗糖定義為一個酶活力單位。
蔗糖酶活力(μg/min/g鮮重)=[1000×(ΔA+0.12)÷0.1296×V1]÷(W×V1÷V2)÷T=771×(ΔA +0.12) ÷W。
1000：1mg/mL=1000μg/mL；V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.1mL；V2：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時間，10min； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g。
測定意義：
蔗糖酶（sucrase）（EC 3.2.1.26）是碳水化合物消化吸收的關(guān)鍵酶之一，能夠水解蔗糖變成相應(yīng)的單糖而被機(jī)體吸收。
測定原理：
本試劑盒采用3.5－二硝基水楊酸法測定蔗糖酶催化產(chǎn)生的還原糖的含量，由此可得出蔗糖酶水解速度。其原理是3.5－二硝基水楊酸與還原糖共熱被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)還原糖的量和反應(yīng)液的顏色深度成正比。此法操作簡便、迅速、雜質(zhì)干擾較小。
所需的儀器和用品：
可見分光光度計(jì)、沸水浴、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
提取液：液體60mL×1瓶，4℃保存；
試劑一：液體2.5mL×1瓶，4℃保存；
試劑二：粉劑×1支 ，4℃保存，用時加入1.5mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑4℃保存；
試劑三：液體5mL×1瓶，常溫保存；
樣品測定的準(zhǔn)備：
按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
加樣表和測定步驟：
| 試劑名稱（μL） | 對照管 | 測定管 |
| 試劑一 | 50 | 50 |
| 蒸餾水 | 50 | |
| 樣本 | 100 | 100 |
| 試劑二 | 50 |
| 試劑三 | 100 | 100 |
| 蒸餾水 | 700 | 700 |
蔗糖酶活力計(jì)算：
1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y = 0.1296x -0.12；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/mL），y為吸光值。
2、按照蛋白濃度計(jì)算
單位定義：每mg組織蛋白每分鐘催化水解1μg蔗糖定義為一個酶活力單位。
蔗糖酶活力(μg/min/mg prot)=[1000×(ΔA+0.12)÷0.1296×V1]÷(V1×Cpr)÷T=771×(ΔA +0.12)÷Cpr。
3、按樣本鮮重計(jì)算
單位定義：每g組織每分鐘催化水解1μg蔗糖定義為一個酶活力單位。
蔗糖酶活力(μg/min/g鮮重)=[1000×(ΔA+0.12)÷0.1296×V1]÷(W×V1÷V2)÷T=771×(ΔA +0.12) ÷W。
1000：1mg/mL=1000μg/mL；V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.1mL；V2：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時間，10min； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g。
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