NETosis Drives Blood Pressure Elevation and Vascular Dysfunction in Hypertension

Keywords: extracellular traps; histones; hypertension; neutrophils; protein-arginine deiminase type 4.

高血壓是心血管疾病最重要的可改變危險因素。中性粒細胞在先天免疫反應中起重要作用，是人體循環中最豐富的白細胞。在人類高血壓中，中性粒細胞計數增加。中性粒細胞還通過稱為 NETosis的過程形成中性粒細胞外誘捕網（NETs）去殺死病原體。NETs 具有促炎性，并在許多疾病條件下的免疫激活和炎癥中發揮作用。在人類和嚙齒動物高血壓模型中，腎臟和主動脈等外周組織的 NETosis 增強，NETs 也存在于高血壓大鼠和小鼠模型的腸系膜血管中。此外，NETs 還促進動脈粥樣硬化和血栓形成，并有助于血小板的活化。

肽酰精氨酸脫亞胺酶4（PAD4）是一種位于中性粒細胞細胞核中的鈣依賴性酶，能催化瓜氨酸化組蛋白H3（H3-Cit）導致染色質解聚，這是NETs形成的關鍵因素。H3-Cit 已被證明可以破壞微血管內皮細胞（ECs）屏障。

機械敏感鈣通道 TRPV4（瞬時受體電位陽離子通道亞家族V 成員4）在中性粒細胞中高度表達。在急性肺損傷模型中，抑制 TRPV4 會減弱中性粒細胞 ROS 的產生、粘附和趨化性。用 TRPV4 激動劑GSK1016790A處理中性粒細胞則以劑量依賴性方式增加 ROS 的產生。

基于這些發現，美國范德堡大學生物醫學工程系、麻醉學系及醫學中心臨床藥理學部研究團隊假設 NETosis 導致 EC 激活和血管功能障礙，從而導致高血壓。觀察結果確定了 NETosis 在高血壓發病機制中的作用。研究成果發表于Circulation Research 期刊題為“NETosis Drives Blood Pressure Elevation and Vascular Dysfunction in Hypertension”。



首先，為了確定 Padi4 在高血壓小鼠免疫細胞亞群中的表達，檢測了用血管緊張素II（Ang II）處理的小鼠脾細胞的單細胞測序數據，發現Padi4 表達在中性粒細胞簇中富集，在其他細胞類型中低表達。為了確定 PAD4 在高血壓中的作用，用Ang II處理 Padi4−/−或 C57Bl/6 對照小鼠，測量收縮壓、舒張壓和平均動脈壓。Padi4−/− 小鼠在第 1 周發展為高血壓，并在接下來的 3 周內表現出收縮壓、舒張壓和平均動脈壓的降低。這說明，PAD4 的缺失減輕了 Ang II 誘導的高血壓。

為了評估 NETosis 對血管反應性的作用，采集腸系膜動脈并確定血管功能。結果未觀察到對硝普鈉的反應差異，然而，Padi4−/− 小鼠對乙酰膽堿的反應改善了血管松弛（圖1 A、B）。為了評估腎臟鈉和水含量，小鼠在Ang II 處理后注射生理鹽水注射，并測量尿量，發現 Padi4−/− 小鼠腎臟鈉和容量排泄提高的趨勢（圖1 C）。此外，與C57Bl/6小鼠相比，Padi4−/− 小鼠的中性粒細胞、樹突狀細胞和細胞毒性 CD8+ T細胞浸潤明顯減少（圖1 D-F）。這些結果表明，Padi4−/− 小鼠表現出內皮依賴性血管松弛改善和主動脈炎癥減少。
 

圖1 NET-缺陷小鼠對Ang II的反應改善了內皮細胞功能，減少了血管炎癥。

接下來，收集原代 C57Bl/6 中性粒細胞，與C57Bl/6 小鼠主動脈 ECs共培養或單獨培養 18 小時。培養的內皮細胞暴露于正常血壓（5%）或高血壓（10%）單軸循環拉伸。在沒有 ECs 的情況下，10% 的拉伸會增加 NETosis。然而，在共培養后，與單獨培養的中性粒細胞相比，當以 5% 或 10% 的拉伸暴露于 ECs 時，中性粒細胞表現出增加的 NETosis。與5% 拉伸或單獨培養的中性粒細胞相比，10% 的拉伸以疊加效應增強共培養中的 NETosis。此外，與 C57Bl/6 中性粒細胞相比，Padi4−/− 中性粒細胞與10% 拉伸暴露的 ECs 共培養導致最少的細胞外 DNA 分泌和 NET 形成。這表明，中性粒細胞與內皮細胞的共培養以及高血壓牽張暴露會增加 NETosis。

進一步地，中性粒細胞與 ECs 共培養 36 小時。與單獨培養中性粒細胞相比，與ECs 共培養顯著提高了細胞存活率。驗證在 ECs 存在下拉伸的效果，發現與 5% 的拉伸相比，10% 的拉伸增加了共培養中的 NETosis（圖2 A、B）。細胞活力評估顯示，與 5% 拉伸相比，10% 拉伸時自殺性 NETosis 增加（圖2 C、E）。
 

圖2 在內皮細胞存在的情況下，長期高血壓拉伸會增加自殺性 NETosis。

最后，收集與 ECs 共培養并暴露于 5% 或 10% 拉伸的中性粒細胞，通過 Western blot 評估 H3-cit。與 5% 拉伸相比，暴露于 10% 拉伸的中性粒細胞表現出 H3-Cit 增加。此外，觀察到暴露于 H3-Cit 的 ECs 中 Icam1、Vcam1、Sell 和 Sele 的表達顯著增加。主動脈環暴露于細胞外組蛋白 H3 或 H3-cit 減弱了響應乙酰膽堿的血管松弛反應。與暴露于對照的拉伸細胞相比，ECs 暴露于 10% 拉伸和 H3-Cit 顯著增加了炎性細胞因子 Il6、Tgfβ 和 Tnfα 的表達。這說明，高血壓拉伸增加中性粒細胞H3-Cit，H3-Cit暴露導致 EC 激活、血管功能障礙和炎性細胞因子表達。

然后，為了確定機械敏感鈣通道 TRPV4 的激活是否會增加中性粒細胞細胞內鈣水平，分離的小鼠中性粒細胞分別用1、10和100 nM的特異性TRPV4激動劑 GSK1016790A處理。結果觀察到，GSK1016790A處理后細胞內鈣呈劑量依賴性增加（圖3 A、B）。為了確定 TRPV4 激動作用是否刺激 H3-Cit 產生和 NETosis，用 GSK1016790A 處理中性粒細胞，并通過免疫熒光評估 H3-Cit 和 NET 的形成，發現 H3-Cit 和 NETosis 呈劑量依賴性增加，且在 100 nmol/L 時顯著增加（圖3 C-E）。這說明，TRPV4 的激活增加中性粒細胞胞內鈣水平并增加 NETosis。

圖3 中性粒細胞中的 TRPV4 激活可增強細胞內鈣和 NETosis。

圖4 圖形概要

總之，該研究表明 NETosis 會導致高血壓、主動脈炎癥和高血壓中的 EC 功能障礙。此外，還表明內皮細胞拉伸是高血壓的標志，是 NETosis 的直接驅動因素。鑒于 NETs 作為心血管疾病的重要因素，高血壓對 NETosis 的影響可能有助于這些疾病的發展和進展。

參考文獻：Krishnan J, Hennen EM, Ao M, Kirabo A, Ahmad T, de la Visitación N, Patrick DM. NETosis Drives Blood Pressure Elevation and Vascular Dysfunction in Hypertension. Circ Res. 2024 May 24;134(11):1483-1494. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.123.323897. Epub 2024 Apr 26. PMID: 38666386; PMCID: PMC11116040.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38666386/

IF：16.5

ISSN：0009-7330

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