DNA倍體分析及細胞周期分析

    在細胞周期內,DNA含量隨細胞內時相發生周期性變化,正常情況下,大多數細胞處于休止期(Go), G1期細胞雖有DNA合成，但DNA含量仍為2N，為二倍體細胞,;處于活躍的DNA合成期(S期)的細胞DNA含量為2N-4N;正經歷細胞分裂(G2/M期)的細胞含有最大量的DNA(4N)。細胞經固定后用PI(Propidium  Iodine 碘化丙啶)等熒光染料染色即可上機測定。但標本需先經RNA酶處理以排除RNA干擾。FCM可在測量大量細胞(數分鐘可測定105個細胞)后給出DNA分布直方圖,見圖12.10.正常人外周血DNA示意圖，圖中第一個峰(G1)是DNA含量為2N 的細胞峰, 第二個峰是DNA含量為4N 的細胞峰,兩峰之間是DNA含量為2N-4N的處于活躍的DNA合成期(S期)的細胞。用廠家提供的Multicycle軟件，計算機可自動計算出G1%、S+G2M%;如用DNA/RNA雙參數分析,可得到G0:G1%,G0/G1期DNA指數, 如標本中有凋亡細胞,在G1峰前會出現一個亞G1期峰,軟件可自動計算出凋亡細胞的%。
圖12.10.正常人外周血DNA示意圖(采自Coulter Training Guide)
DNA倍體分析的臨床有價值的指標是DNA非整倍體和/或超二倍體%和四倍體%增高。這些改變是腫瘤細胞的特異性改變,和實體瘤相比,急性白血病非整倍體發生率較低,約30～40%。

淋巴細胞亞群測定

    淋巴細胞擔負著免疫的主要功能。淋巴細胞亞群的測定有助于了解機體免疫狀況及一些疾病的監測。臨床經常測定的淋巴細胞亞群包括T淋巴細胞 (CD3+), T 輔助細胞 (CD3+CD4+), T 抑制細胞(CD3+CD8+), B 淋巴細胞（CD19+或CD20+），NK 細胞 (CD3-CD56+)等。
常用來測定淋巴細胞亞群的單克隆抗體(Monoclonal  Antibody McAb)都是小鼠抗人Ig,有精制抗體,有直標熒光抗體,現在一些國外公司有雙色和三色McAb出售,如CD4-FITC/CD8-RD1、CD3-CY5/CD4-FITC/CD8-PE等,此時應根據這些雙色或三色McAb的Ig性質選擇相應的陰性對照,如MsIgG1-RD1/MsIgG2-FITC等。上機測定時應先測定陰性對照管,陰性對照的陽性細胞應＜2.0%。
三色測定可給出更為準確的各亞群的情況:如真正的T 輔助細胞應是 CD3+CD4+CD8-, 真正的T 抑制細胞應是 CD3+CD4-CD8+,單標CD8+細胞中不僅有T 抑制細胞,還含有30%左右的NK細胞;而CD3+CD4-CD8-細胞群是γδT細胞,此類細胞與感染有關, CD3+CD4+CD8-細胞+CD3+CD4-CD8+細胞+CD3+CD4-CD8-細胞+CD3+CD4+CD8+細胞=CD3+細胞。如單標記CD56不能準確測定NK 細胞,NK 細胞應是 (CD3-CD56+),因為CD56+細胞中包含著非HLA束縛細胞毒T 細胞(CD3+CD56+)。雙色組合還能測定B 淋巴細胞（CD3-CD19+或CD20+）、激活的T 細胞(CD3+CD69+或CD3+25+)等。
應用適當的雙色組合如CD4與CD29,CD4與CD45RA,可以測定T輔助細胞的的亞群。如CD4+2H4(CD45RA)+細胞是Ts的誘導細胞;CD4+4B4(CD29)+細胞Th的誘導細胞。同理,利用CD8+CD45RA和CD8+CD29+S6F1可測定T抑制細胞的亞群。
T輔助細胞還可分成Th1、Th2兩個亞群，同時標記細胞內細胞因子IFN-γ和IL-4，可區分Th1細胞（CD4+/ IFN-γ+）和Th2細胞（CD4+/ IL-4+）。
利用CD25、CD69等McAb和其他淋巴細胞標記雙色或三色標記還可測定淋巴細胞亞群的功能狀態，如活化T8、活化B細胞等。
    以下給出常用細胞亞群的正常范圍供參考,請注意同一CD中有多種克隆的McAb, 同一CD中不同McAb所測出的數值不同,每個實驗室應測定自己實驗室的正常數值。
    CD3+             70.0±12.0%      +4B4+                23.0±7.0%
    CD3+CD4+CD8-      40.0±9.0%         CD4+2H4+                19.0±6.0%
    CD3+CD4-CD8+      30.0±8.0%
CD3-CD56+(NK)     12.0±8.0%

白血病免疫分型原理

    白血病免疫學分型是利用單克隆抗體(McAb)檢測白血病細胞的細胞膜和細胞漿抗原,分析其表現型,以了解被測白血病細胞所屬細胞系列及其分化程度。對白血病細胞抗原的分析研究有助于對白血病分型,為診斷和治療提供依據。白血病免疫分型是形態學分型的重要補充和進一步深化，國際MIC分型協作組認為每一例急性白血病的免疫分型都是必不可少的。白血病免疫分型對鑒別急淋和急非淋有決定作用，對鑒別急非淋的某些亞型如M7、M3也有決定作用，對于一些用形態學、細胞組織化學不能診斷的急性白血病，急性未分化白血病，混雜性白血病等有重要意義。自從單克隆抗體問世以來,最成功的應用就是研究造血系統各類細胞表面抗原與細胞增殖、分化及惡變的關系。研究發現細胞表面抗原有重要功能,一些抗原分子作為細胞生長因子的受體而影響細胞的增殖分化;一些抗原分子作為細胞間相互識別的物質基礎而參與細胞間相互作用;一些抗原分子則是細胞特異功能的物質基礎。
    從多能造血干細胞(PHSC)分化成熟為功能細胞過程中, 細胞表面和細胞漿內抗原隨著分化成熟過程不斷發生改變, 這些抗原稱為造血細胞分化抗原。造血細胞分化抗原是造血細胞分化過程中由細胞核內染色體上的基因編碼的鑲嵌蛋白, 其出現、增多、減少或消失與造血細胞分化密切相而表現出與細胞系列及分化程度相關的特異性。這些抗原可作為鑒別和分類造血細胞的標記。如髓系細胞的MPO、CD33、CD13、CD14、CD15等抗原;巨核系的CD41、CD41、CD61抗原; T淋巴細胞的CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8等抗原;B淋巴細胞的CD19、CD20、CD22等抗原。至今尚未發現白血病細胞特異性抗原，而白血病細胞是造血細胞在某一分化階段的大量積累,表達與之相應的造血細胞分化抗原，因此可用造血細胞分化抗原類標記檢測白血病細胞; 但白血病細胞畢竟不是正常造血細胞,其抗原表達與正常造血細胞并不完全相同。常有丟失某一分化發育階段正常應有的抗原,或表達某一分化發育階段正常不應有的抗原，或表達其他系列抗原，部分喪失了系列專一性和分化的嚴格性。
用FCM檢測白血病免疫分型具有快速、簡便、重復性好等優點。由于FCM可根據FSCνSSC直方圖區分細胞并可圈定檢測細胞范圍(Bitmap，無定型門),或用SSC(線性或對數)和CD45直方圖圈定檢測細胞范圍(Bitmap，無定型門)，排除其他細胞干擾，因此較光學顯微鏡免疫熒光法或免疫組化法結果更準確。

白血病免疫分型其臨床意義

     目前公認的系列特異性指標是:T淋巴細胞系--胞漿CD3（cCD3）,B淋巴細胞系-- cCD22或cCD79，髓系---MPO 或cCD13,一般可先用他們區分細胞系列后再進一步分析某一系列亞型和分化階段。
1. ALL的免疫學分型
1986年前分為普通型ALL（cALL）、未分化細胞ALL （Null-ALL）、T細胞ALL（ T-ALL） 、前B細胞ALL （PreB-ALL）、B細胞ALL （B-ALL）五型;1986-1994年分為兩大類九型(非T-ALL六型,T-ALL三型),九十年代后期有人按臨床實用性一般分為B祖細胞ALL、前B細胞ALL、B細胞ALL、T細胞ALL四型。表12.1-表12.4列出ALL的五型、九型（ B細胞系列六型、T細胞系列三型）、四型分類法。

 B-祖細胞 ALL :B-祖細胞ALL 占兒童ALL的65%-70%,青少年ALL的55%-60%,成人ALL的50%,兒童ALL >90%病例 CD10+，而嬰兒CD10+病例<50%。FAB分類為L1、L2，白血病細胞的FS和SS都很低;一般TdT、HLA-DR、CD19陽性，大多數病例CD24、CD34陽性，本型細胞膜免疫球蛋白(Ig)陰性。此型有CD10+、CD10-兩個亞型，CD10+型預后較CD10-型好。
前B 細胞ALL ：前B 細胞ALL在發育階段上較B祖細胞 ALL晚，占兒童ALL的25%，在成人ALL占的比例還不清楚。一般CD24、HLA-DR、CD19、 CD10、cCD22陽性，CD34陰性,鑒別特點時有胞漿重鏈μ。此型預后較B祖細胞ALL差，可能與t(1;19)有關，t(1;19)占前B 細胞ALL的25%，此型CD34-，而B系列ALL中CD34-是獨立的預后不良標記。
B細胞ALL ：B細胞ALL 占所有ALL 的2%-5%；B細胞ALL更為成熟，白血病細胞的FS和SS較B-祖細胞 ALL明顯增加，在FSνSS直方圖或SS(線性或對數)νCD45直方圖中處于淋巴細胞和單核細胞區域。典型標記是細胞膜免疫球蛋白（sIg）陽性,表型一般為CD19、CD20、CD22、CD24陽性,多數病例CD10+，但sIg和成熟抗原出現可區別于更早的B系ALL。此型FAB分類一般為 L3,罕見病例有B細胞ALL標記而FAB分類一般為 L1，這些病人多有t(1;19)和t(14;18)。

T細胞ALL ：T細胞ALL占兒童ALL的15%,成人ALL的25%。多數表型為胸腺細胞型，最常見的是晚期胸腺皮質細胞亞型，CD1+、CD2+、CD5+、CD7+,CD4+CD8+，CD3表達較少，TdT常陽性；另一常見亞型是早期胸腺皮質細胞亞型，CD2+、CD5+、CD7+、TdT+。髓質期亞型較少見，CD2+、CD5+、CD7+，CD3+CD4+或CD3+CD8+，TdT表達較少。前T細胞亞型，僅有CD7和cCD3而無其他T系抗原表達，預后較差。T系腫瘤性疾病多有特異性正常抗原表達的下調或表達該分化階段正常不應出現的抗原。成人T細胞ALL預后較好，而兒童T細胞ALL較兒童B-祖細胞 ALL和前B細胞 ALL預后差，雖然各亞類預后仍不甚明確，但CD10陰性者預后不良。
    
ALL 的免疫學分型經過1986年前分為五型，1986-1994年分為兩大類九型,九十年代后期(1997)分為四型的過程。1986年前的五型，是當時單克隆抗體和檢測手段的反映；隨著新的單克隆抗體（主要是T、B淋巴細胞亞群的McAb）的發現和臨床大量病例的檢測，不僅弄清了T、B淋巴細胞的來源、分化發育過程，而且使免疫分型更加細致，因而出現了1986-1994年分為兩大類九型；但按照細胞的分化發育階段分型的兩大類九型分型法對臨床略顯繁瑣，指導治療、判斷預后臨床實用性也不夠強，因此又出現了以上簡單的四型分類法。經過對比不難看出，四型分類法的B-祖細胞ALL型實際上包含了兩大類九型分類法的非T-ALL的Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 3個亞型，而Ⅴ型即是前B 細胞ALL型，Ⅵ型是B 細胞ALL型；而T細胞ALL型是兩大類九型中T-ALL的三型合并為一型。兩大類九型分類法的非T-ALL的Ⅰ型分類為急性未分化白血病（見后）。
ALL也可按DNA含量分類，用流式細胞儀很容易測定DNA含量，DNA含量分為兩個亞類：超二倍體和亞二倍體，前者預后好，后者預后差。

2.急性髓細胞白血病(AML)攪
目前所有粒、單核系的單克隆抗體基本無分化發育階段特異性,因此AML的免疫學分型FAB-M0、M1、M2界限不十分明顯;但M3多不表達HLA-DR和CD34，常表達CD13、CD33、CD9、CD38；GPA在鑒別紅白血病(M6)時可提供幫助;巨核細胞白血病(M7)則有CD41、CD42、CD61為系列特異標記,為確診的重要指標。由于白血病的異質性,同一FAB分類的白血病抗原表達并不完全相同。AML的免疫表型見表12.5。

M0：M0白血病細胞的FS和SS都很低，在SSνCD45直方圖中處于原始淋巴細胞區域。M0的白血病細胞至少表達一個髓系特異性標記如MPO、CD13、CD116，MPO較CD13、CD116更敏感；一般淋巴系標記是陰性的，但可能表達CD7或CD4；一般CD34、HLA-DR陽性。有研究顯示AML復合表達CD7和CD34預后不良。
M1：M1的白血病細胞抗原表達類似于M0并與M0不好區分，M1一般表達CD13，CD33和HLA-DR，CD34表達較M0少，部分可能表達CD15，較少病人可能表達CD4。
M2：M2與M1的主要區別是分化成熟增加，原始細胞減少；CD34表達較M1少，CD15表達較M1增加，大部分病例HLA-DR陽性，CD13表達強于CD33；部分M2表達CD19和CD56伴有t(8;21)，罕見的伴有t(8;21)的M2不表達CD13，CD33和CD14但MPO陽性。

M3：M3白血病細胞由于它的高顆粒性而SS增大；M3的白血病細胞一般表達CD13，CD33，部分病人可能表達CD2，但HLA-DR陰性，CD34一般為陰性，復發病人陽性；部分病人可能表達CD56，表達CD56者應作基因檢查(APL/RARα)以排外髓/NK細胞急性白血病(詳見后)。
M4、M5：M4、M5的免疫表型相似，重要表型特點是表達CD13、CD33、CD14、CD15和HLA-DR，部分病人表達CD4、CD7,部分病人可能表達CD56，表達CD2多為M4E0，常伴有16號染色體異常，預后好。
M6：M6較少見，一般表達HLA-DR、CD34、CD13、CD33，GPA對確定紅系有用。
M7：M7占成人ANLL的1%、兒童的4%。成人M7多見于二次性白血病,即CML.BC或MDS-RAEB或MF白血病變。而兒童M7多為原發。M7免疫學表型一般為:CD41+,CD42+,CD61+,CD33+/-,CD13+/-,CD34+,DR+/-,CD10-。特異性標記CD41、CD42、CD61陽性可確診M7，但要注意排外血小板粘附于細胞上的假陽性結果。

3．急性未分化白血病  用流式細胞儀分析僅有大約1%的急性白血病不能分類，典型急性未分化白血病僅有HLA-DR和CD34表達而無系列特異性抗原表達。

4．雜合型白血病   真正的雙系列表型白血病是伴有t(9;22)或有11q23 MLL（myeloid/lymphoid or mixed lineage leukemia髓/淋系或混合性白血病）基因重排的病人，以往報道的許多雜合型白血病多是由于方法學問題不能排除非白血病細胞的干擾，或將非特異弱表達當作特異表達，如前所述白血病細胞畢竟不是正常造血細胞,其抗原表達與正常造血細胞并不完全相同，部分喪失了系列專一性和分化的嚴格性，因此不要輕易定型雜合型白血病，國際上雜合型白血病尚無統一診斷標準。

5．慢性粒細胞白血病急性變(CML BC)   慢性粒細胞白血病(慢粒 CML)是一種多能造血干細胞疾病,其轉歸多為急性變。慢粒急變(CML BC)涉及所有造血細胞系列,往往不易從形態學上確定急變類型, 50%-60%為AML變,30%左右為ALL變。AML變可表達AML的所有表型，大多數ALL變為B細胞來源,其中cALL及前B-ALL多見,罕見T-ALL變。  

6．B 淋巴系細胞增殖性疾病   B 淋巴系細胞增殖性疾病的免疫學分型見表12.6。采自C.D Jennings and K A.Foon略加改變.  MCL: mantle cell 淋巴瘤; FCCL:Follicular center cell lymphoma---瀘泡中心細胞淋巴瘤;  MZL: Marginal zone lymphoma—邊緣區淋巴瘤; SLL:small cell lymphocyte lymphoma--小細胞淋巴細胞淋巴瘤

B 淋巴系細胞增殖性疾病中包括B慢性淋巴細胞白血病(B-CLL)、B幼淋細胞白血病（B-PLL）、毛細胞白血病（HCL）和多發性骨髓瘤（MM）/漿細胞白血病和部分淋巴瘤，淋巴瘤免疫分型將在不同章節中描述。
B-CLL：B-CLL的白血病細胞一般表達CD19、CD20、CD43和CD79a，CD5與以上抗原復合表達，sIgM、sIgD、CD11c和CD25也常表達但表達較弱，CD10、CD22陰性。伴染色體異常者預后較差。
B-PLL ：流式細胞儀在區分B-PLL和B-CLL中十分有用, B-PLL通常sIg表達強, CD5陰性而CD22陽性,困難的是原發B-PLL和由B-CLL轉化為B-PLL的區分, 由B-CLL轉化來的B-PLL CD5陽性而CD22表達弱,類似于B-CLL。
HCL：HCL 一般表達成熟B細胞標記:CD20、CD22、CD19、CD79、sIg，CD11c、CD22高表達，CD25中等度以上表達，一般CD21-，典型病例CD5-、CD10-、CD23-，但有少數病例可陽性。CD103是HCL最可信的標記，可用來與其它B細胞白血病鑒別。
漿細胞瘤：由于大多數多發性骨髓瘤病人骨髓標本中含骨髓瘤細胞少及瘤細胞喪失了大多數B細胞系特異性標記，用流式細胞儀分析多發性骨髓瘤（MM）/漿細胞白血病較為困難，典型的漿細胞CD38強表達而CD45弱表達。一般漿細胞sIg弱表達,cIg陽性。

7．T淋巴系細胞增殖性疾病  T淋巴系細胞增殖性疾病的免疫學分型見表12.7。

T淋巴系細胞增殖性疾病中包括T幼淋細胞白血病（T -PLL）、NK細胞白血病（T-LGL、NK-LGL）和成人T淋巴細胞白血病（ATL）、T慢性淋巴細胞白血病(T-CLL)。
T-PLL ：T-PLL的白血病細胞一般表達CD2、CD3、CD5和CD7，大多數病人CD4+ CD8-,但偶有CD4+ CD8+,單獨表達CD8者少見, 本病常伴有14q11和14q32改變, 有CD4+ CD8-表型者預后較好,本病較B-PLL惡性度高。

NK 細胞白血病 ：NK系列白血病最早描述的是大顆粒淋巴細胞白血病（LGL）, LGL有兩種類型：T-LGL和NK-LGL，T-LGL表達CD3、CD8、CD2、CD16、CD11b、CD57、而CD56、CD5、CD7、CD4和CD25多陰性，有TCR基因重排。NK-LGL表達CD2、CD16和CD56，而CD3、CD4多陰性，CD8、和CD57弱表達或陰性，無TCRα-β基因重排。最近NK系列白血病又有新的亞型發現，如急性前髓系/NK 細胞白血病、急性髓系/NK 細胞白血病、原始NK 細胞白血病、NK樣T細胞白血病。急性前髓系/NK 細胞白血病是一種最近認識的不同類型的白血病, 其特點是有明顯髓外涉及,不成熟的原始淋巴細胞樣形態,伴MPO--、CD7+、 CD33+/CD13+、sCD3-、cCD3-、CD56+,預后不良。急性髓系/NK 細胞白血病，形態學和免疫表型類似于M3,但無RARα基因重排，一般HLA-DR-、CD33+、CD13+、CD56+，多見于老年病人，對維甲酸無反應。原始NK 細胞白血病，無髓系和淋巴系抗原，CD56+、cCD3+/-、CD2+/-、CD4+/-、CD7+/-，少數有TCRβ基因重排，而無TCRγ-δ基因重排。NK細胞系列白血病的新亞型是近10年才較多注意到的白血病,其臨床特點,免疫表型,染色體及基因改變需進一步積累病例研究才能徹底明了。大約10%-20%左右的急性白血病表達CD56，除了原始NK 細胞白血病、NK樣T細胞白血病、急性髓系/NK 細胞白血病、急性前髓系/NK 細胞白血病外，大部分表達CD56的急性白血病是FAB分類的M2、M3、M4、M5型，這類病人究竟是急性髓系/NK 細胞白血病還是急性髓系細胞白血病伴NK抗原表達有待進一步研究，鑒于急性白血病部分喪失了系列專一性和分化的嚴格性，可能稱為急性髓系細胞白血病伴NK細胞抗原表達較為合適。
成人T淋巴細胞白血病(ATL)：大多數ATL細胞表達激活T細胞表型：CD3、CD4、CD5、CD25、HLA-DR、TCR，一般CD7-和CD8-,常有粘附分子L-選擇素的異常表達； 伴有p53異常者預后不良。
T-CLL：T-CLL少于CLL總數的1%，細胞形態學類似與一般CLL，但臨床發展較快，但多數病人表達CD2、CD3、CD5、CD7、CD4、少數病人表達CD8。

淋巴瘤免疫分型

目前淋巴瘤的分類方法已從LSG的形態學分類逐漸轉變為REAL分類法, REAL分類法是以腫瘤發生源為基礎的分類方法,在原來的形態學基礎上加上免疫學分型后再加以分類,這種分類方法不僅能夠推斷腫瘤的發生源,對治療也有指導意義。因此淋巴瘤的免疫分型越來越重要。如同白血病免疫分型一樣，淋巴瘤的免疫分型也是利用單克隆抗體檢測淋巴瘤細胞的細胞膜和細胞漿抗原,分析其表現型,以了解被測淋巴瘤細胞所屬細胞系列及其分化程度。流式細胞儀能對多數的淋巴瘤細胞的細胞膜和細胞漿抗原迅速客觀地做出檢測，在淋巴瘤的免疫分型中起著不可替代的作用。

臨床淋巴瘤的免疫分型的檢測標本一般是淋巴結、脾臟、胸水、腹水等。在臨床淋巴瘤的免疫分型工作中常可遇到以下四種情況：①B細胞系淋巴瘤②T/NK細胞系淋巴瘤③淋巴細胞系以外的造血細胞腫瘤④造血細胞以外的腫瘤。
REAL分類淋巴瘤的免疫表型見表12.8。*：弱表達或陰性。
BLBL :前B原始淋巴細胞淋巴瘤/白血病; BSLL: B-小淋巴細胞淋巴瘤; LPL:淋巴漿細胞樣淋巴瘤; MCL: 斗篷細胞淋巴瘤; FCL:濾泡中心淋巴瘤; MZL: 邊緣帶B細胞淋巴瘤; SMZL :脾MZL ;HCL:毛細胞白血病; PC:漿細胞瘤;DLBL: B-彌漫性大細胞淋巴瘤; BL: Burkitts淋巴瘤; HBLB:高度B細胞淋巴瘤, Burkitts樣; TLB L: 前T原始淋巴細胞淋巴瘤/白血病; TPLL: T幼淋細胞白血病; LGLT:大顆粒淋巴細胞白血病, T細胞型; LGLNK: 大顆粒淋巴細胞白血病, NK細胞型; MF:覃樣真菌病; PTL:外周T細胞淋巴瘤,非特異;AILD:血管免疫T細胞淋巴瘤;ACL:血管中心性淋巴瘤;  ITCL:腸T細胞淋巴瘤; ATL:成人T細胞淋巴瘤/白血病; LCL:大細胞淋巴瘤; LCLH: 大細胞淋巴瘤,何杰金氏樣;

1． B細胞系淋巴瘤    大多數情況下, B細胞系淋巴瘤CD19、CD20陽性，分化早期CD20陰性，CD10、CD34陽性；分化晚期CD5、CD23陽性，成熟為漿細胞后以上標記均陰性。利用單克隆抗體κ、λ（正常時κ：λ=2：1）可檢測免疫球蛋白輕鏈的偏移，推斷是否克隆性增殖免疫球蛋白。表12.6. 列出了外周B 淋巴系淋巴瘤的4種類型的免疫分型。
SLL(small cell lymphocyte lymphoma)--小細胞淋巴細胞淋巴瘤: 小細胞淋巴細胞淋巴瘤細胞一般表達CD19、CD20、CD43和CD79，CD5與以上抗原復合表達，sIgM、sIgD、CD11c和CD25也常表達但表達較弱，CD10、CD22陰性。伴染色體異常者預后較差。

MCL（mantle cell lymphoma）--斗篷細胞淋巴瘤：MCL包括以前分類為中等淋巴細胞淋巴瘤（ILL）、中度分化淋巴細胞淋巴瘤(IDL)、中心細胞淋巴瘤和套區細胞淋巴瘤（MZL）,占淋巴瘤的2%-8%，λ型較κ型常見， sIgM中度表達,IgD弱或陰性，表達CD19、CD20、CD22、CD43，但多數病例CD5陽性CD23陰性，CD10一般陰性，CD5陽性CD23陰性和Ig類型可幫助鑒別MCL和FCL。
FCL（Follicular center cell lymphoma）---瀘泡中心細胞淋巴瘤：FCL占淋巴瘤的45%，表達CD19、CD20、CD22， sIg強表達,但多數病例CD10和CD23陽性，典型FCCL CD5、CD43和CD11c陰性。CD10陽性、CD11c陰性和sIg強表達利于與MZL鑒別。
MZL（Marginal zone lymphoma）--邊緣帶淋巴瘤和相關B 細胞淋巴瘤：典型免疫表型: CD19、CD20、CD22、HLA-DR陽性，sIg中度表達，CD5、CD10、CD23、CD25陰性，CD21、CD24多數情況下陰性，多數表達CD11c。CD5、CD10、CD23、CD25陰性，CD21、CD24多數情況下陰性，利于與CLL/SLL、FCCL、MZL鑒別。

2． T/NK細胞系淋巴瘤   早期T細胞一般CD2、CD5、CD7、cCD3陽性。T/NK細胞系淋巴瘤的詳細分類及表型參見表12.8。細胞膜CD3陽性可確認為外周T細胞腫瘤, 外周T細胞腫瘤的特征是CD3與CD4或CD8復合表達，并常有克隆性T細胞受體，或α-β型或γ-δ型；
MF（mycosis fungoides）--蕈樣真菌病和sezary綜合癥:占皮膚淋巴瘤的絕大多數，CD4陽性，同時表達CD2、CD3、CD5，有時CD7陰性，CD8陽性病例極少見但已有報道，有無TCRβ基因重排對鑒別淋巴瘤和炎性反應有幫助。
LCL（large cell lymphoma）--大細胞淋巴瘤: 大細胞淋巴瘤（LCL）占成人淋巴瘤的40%，兒童的1/3，成人80%是B細胞型的，兒童B細胞型和T細胞型各占一半。
3． 淋巴細胞系以外的造血細胞腫瘤  急性髓系細胞白血病（特別是M4、M5）淋巴結轉移時有發生，如T、B淋巴細胞標記低表達應懷疑并按白血病免疫分型處理。
4． 造血細胞以外的腫瘤  檢測淋巴結、胸腹水標本時如遇CD45陰性情況應考慮非造血系統腫瘤淋巴結、胸膜、腹膜轉移。

紅細胞疾病診斷

（一）網織紅細胞測定
    計數外周血中網織紅細胞數量,對于評價骨髓紅系造血及網織紅細胞從骨髓到外周血的轉送速率有重要意義。有核紅細胞在成熟過程中,脫去細胞核后仍有少量RNA殘留在細胞漿內,再經過約一天時間殘留RNA完全消失,成為成熟紅細胞。這種細胞漿內有殘留RNA的紅細胞稱作網織紅細胞。正常情況下有一定量的網織紅細胞出現在外周血中,正常值為1.0～1.5%,上限3.0%,但當紅細胞數異常時會出現錯誤結果。因此用網織紅細胞絕對值表示,正常值5～15×1010/L。由于常規方法測定須先在體外經活體染色(最常用亞甲蘭),然后在顯微鏡下計數,計數細胞數有限。用流式細胞儀測定網織紅細胞具有以下優點:①可避免由于細胞核的碎片或鐵幼粒細胞的顆粒的存在而出現假性網織紅細胞升高②可避免人為誤差③因為可在短時間內測量上萬個細胞,結果較常規方法準確、可靠,④同時可給出網織紅細胞年齡結構。
流式細胞儀測定網織紅細胞方法簡單,只須將紅細胞洗凈后用熒光染料染色后即可上機檢測。常用的熒光染料有焦寧Y(Pyronin Y) 丫啶橙(Acridine OrangeAO) 碘化丙啶(崐Propidium Iodine PI) 花青( Cyanine dye)等。

（二）PNH診斷
陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥（PNH）因血細胞膜上錨固蛋白-糖磷酸肌醇（GPI）減少或缺乏而導致與GPI有關的補體激活抑制因子如CD55、CD59減少或缺乏，因而紅細胞對補體異常敏感發生溶血。流式細胞儀檢查CD55、CD59十分敏感，正常人CD55、CD59雙陽性細胞>95%，PNH病人CD55、CD59明顯減少，這種減少不僅表現在紅細胞上，粒細胞、淋巴細胞也有減少。已發現CD55c可能對GPI減少或缺乏較CD59更敏感。

 血小板功能分析和血小板病診斷

（一） 血小板功能分析
   血小板膜上有豐富的糖蛋白受體，是血小板發揮其功能的物質基礎，靜止期和活化期血小板的膜糖蛋白受體的種類、含量、結構和功能顯著不同，用不同的抗血小板單克隆抗體可測定和分析血小板功能狀態。血小板質膜糖蛋白單克隆抗體CD41(GPIIb/IIIa)、CD61(GPIIb/IIIa)、CD42b (GPIb)、CD41b (GPIIb)、血小板顆粒膜糖蛋白CD62p、CD63的測定可供分析血小板功能狀態，如CD62p、CD63正常血小板不表達，當血小板活化時表達明顯增加，可用來測定活化血小板。

（二）血小板病診斷攪
1．血小板相關抗體測定   血小板相關抗體可因不同機制產生。抗血小板自身抗體(包括原發性、藥物誘導產生、合并其它自身免疫性疾病如系統性紅斑狼瘡)能引起嚴重的血小板減少。大多數原發性(免疫性)血小板減少性紫癜病人血小板上和/或血清中有抗自身血小板的血小板相關抗體PAIgG、PAIgA、PAIgM。血小板相關抗體的抗原仍不十分清楚,可能有多種,如GPⅠb、GPⅡb 、GPⅢa、Pa、或HLA抗原。抗血小板自身抗體也可能發生于多次輸血后或懷孕期間,這些自身抗體多為針對HLA-Ⅰ類抗原決定簇的抗體,一般是IgG,它們可迅速破壞和清除隨機供血者的血小板。因此能迅速測定這些抗體存在與否的方法是必需的。許多不同的利用放免、熒光、酶、SPA等的測定血小板抗體的方法已建立,但這些方法都很復雜、費時;同時給出的結果只能以一定量的血小板(105)中有多少抗血小板抗體來表示。近年來發展起來的用FCM測定血小板抗體的方法具有快速、簡便的優點,同時可測定血小板上和血清中的抗體;測定中FCM分析每一個血小板表面有無抗體,能給出血小板群體中有多少血小板表面有抗體(以%表示);同時能給出血小板相關抗體量與血小板數的直方圖,使我們了解血小板相關抗體在血小板群體中的分布情況。

FCM測定血小板抗體原理:分別用標有熒光的抗人IgG、IgA、IgM或用抗血小板GPⅠb、Ⅱb、Ⅱb/Ⅲa的抗體與分離洗凈的病人的血小板和在病人血清中孵育過的正常O型血小板作用后用FCM測定,前者測定的是病人血小板上的抗體后者測定的是病人血清中的抗體。
2．血小板無力癥   血小板無力癥時血小板膜GPIIb/IIIa明顯減少，用血小板質膜糖蛋白單克隆抗體CD41、CD61和流式細胞儀測定不僅可測出GPIIb/IIIa減少，CD42a、CD42b基本正常或偏高，還可測出GPIIb/IIIa減少程度，分類血小板無力癥。
3.巨大血小板綜合征（BSS）:血小板巨大, CD42a減少，CD42b減少，CD61 增加。

微小殘留白血病檢測

    微小殘留白血病(Minimal Residual Leukemia MRL)是指白血病經治療后獲得完全緩解(Complete Remisson CR)后體內殘留少量白血病細胞的狀態。微小殘留白血病與明顯白血病(Overt leukemia)無明確界限,僅是白血病細胞負荷數量不同,一般成人明顯白血病時白血病細胞可達1012,經治療獲CR后≤1010,因此MRL狀態白血病細胞數可能是100-10攪。MRL是白血病復發的根源,因此檢測MRL有十分重要的意義: ①指導臨床治療②預測白血病復發③評價自體骨髓移植的凈化效果。應用FCM檢測MRL的優點在于可在短時間內分析大量標本,具有快速的特點。
    由于白血病細胞缺乏特異性標記,FCM檢測MRL的效果尚不理想,敏感性尚不夠高，一般僅有1/103-104。目前主要有兩類檢測方法: ①用FCM分析CR期骨髓細胞核酸量或染色體,可用于部分AL病人MRL分析,但敏感性僅1-5%。②免疫表型分析,由于尚無白血病特異的標記,只能通過與正常細胞比較某些抗原量的差別及分布部位的不同作為檢測依據;如利用TdT和CD10雙標記檢測MRL,但敏感性亦不高,約0.1-1%。   
假陰性結果可能由于: ①標本中的白血病細胞＜10-4攪或＜10-5;②所取標本不能代表全身骨髓情況; ③病人白血病細胞表型轉換。

白細胞吞噬功能測定

粒、單核-巨噬細胞是機體免疫反應和免疫調節細胞中的重要成員。它們不僅具有吞噬功能,吞噬外來的微生物、腫瘤細胞等,同時又分泌多種生物因子參于免疫反應,此外單核-巨噬細胞對抗原物質的攝取、修飾、遞呈等作用,是淋巴細胞的免疫功能必不可少的。因此檢測白細胞吞噬功能對了解機體免疫狀況有重要意義。以下簡要介紹FCM測定白細胞吞噬功能的概況。

應用光學顯微鏡、熒光顯微鏡測定白細胞吞噬功能時須分離粒、單核細胞, 并盡可能地保持細胞活性。用FCM檢測時不須分離細胞,應用全血即可, 因此可在自然狀態下測定,結果準確可靠。

 目標粒子一般以酵母、細菌等能激發自然吞噬作用或予先以抗體調理化的人造粒子為好;并標以熒光,常用者為FITC(異硫氰酸熒光素)或RA(羅達明).

以肝素或拘櫞酸抗凝取外周血(避免用EDTA),200μl全血與目標粒子200μl(目標粒子濃度4×107/ml)置37°C溫育,溫育結束后立即置冰水中, 以同樣標本不在37°C溫育而置于冰水中者作為對照。目標粒子不同溫育時間不一,FITC標記的金黃色葡萄球菌25分鐘,FITC標記的粒子15分鐘即可達到吞噬飽和;此外,粒子與白細胞的比例也很重要,一般為10:1。溫育結束后以溶血劑溶去紅細胞即可上機檢測。
 
 應用FCM全血法測定白細胞吞噬功能,對白細胞的丟失、損傷最小;此外用本法可測定血清中的調理素(Opsonine)水平及血清中有無吞噬作用抑制因子。如果用FITC標記的單克隆抗體 CD13、CD14、CD15標記粒、單核細胞,用紅熒光標記目標粒子,即可測定吞噬功能與細胞表面標記的關系,對白細胞吞噬功能作進一步的研究。

NK和LAK細胞活性測定

NK細胞存在于外周血大顆粒淋巴細胞中,它對靶細胞的細胞毒活性不依賴于抗體,無MHC限制性,它們的數量及細胞毒活性是機體免疫系統的重要指標。人NK細胞一般表達CD56、CD16、CD57部分表達CD2、CD8、CD11而不表達CD3。

LAK(Lymphokine Activated Killer cells)細胞主要存在于LGL的高密度群體中,LAK前體細胞表達NK細胞標志CD16而不表達T細胞標志如CD3、CD4、CD5等;它們不需要抗原刺激就能殺傷NK細胞不能殺傷的腫瘤細胞,并且無MHC限制性;從表型上看大多數LAK細胞來自NK細胞,但嚴格講LAK細胞對K562細胞的殺傷活性不能稱作LAK活性,測定LAK活性的靶細胞應為NK抵抗的實體瘤細胞,如HL-60細胞、HeLa細胞等。

常用的測定NK和LAK細胞活性的方法較多,如攩51Cr釋放法、[3H]TdR參入法或釋放法、LDH釋放法、ATP發光法等;應用放射性同位素對人體和環境不利,利用FCM測定NK和LAK細胞活性從1986年就開始摸索,方法已趨于成熟,以下介紹其中一種:

肝素抗凝取外周血后分離PBMC后洗凈,調整細胞濃度為106/ml,為效應細胞;靶細胞分別為K562和HL-60或HeLa細胞,在對數生長期受集細胞,調整濃度為106。用3mMDiO(3,3-Diacradecyloxacarbocyanine Perchlorate)標記靶細胞,效應細胞:靶細胞(E:T)為40:1、20:1、10:1和5:1,孵育后加入PI(10μg/ml)染死細胞,洗凈后即可上機檢測。DiO發綠熒光,PI發紅熒光,利用雙參數(FL1vFL2)直方圖可清楚地了解靶細胞中的死亡細胞,計算出靶細胞%溶解率。

造血干/祖細胞測定

造血干/祖細胞移植已廣泛應用于血液腫瘤、實體瘤、某些遺傳性疾病、免疫缺陷病等，因此檢測造血干/祖細胞已成為臨床必不可少的手段。應用流式細胞儀多色技術測定外周血造血干/祖細胞，具有快速、準確的優點，不僅能確定造血細胞數量，而且能對造血干祖細胞的質量進行評價，為臨床干細胞移植治療提供重要數據。目前多色組合一般包括CD34、CD38、HLA-DR等McAb。

CD34抗原是一種分子量約11萬的糖蛋白，選擇性地表達于早期造血干/祖細胞、小血管內皮細胞和胚胎纖維母細胞表面。該抗原在原始造血細胞上表達，以后隨細胞分化、成熟逐漸減少直至消失，因此一直作為造血干/祖細胞表面的一種特征性標志而廣泛應用于造血干細胞基礎研究和臨床。CD34+細胞是一群不均一的群體，依其是否表達CD38、HLA-DR、CD33、c-kit等分出的亞群表現出了不同的造血性能。最近隨著造血理論的深入研究關于造血干細胞究竟是否都是CD34+細胞出現一些爭論,實驗研究證明, CD34-造血干細胞較CD34+造血干細胞更具造血潛能,有人經實驗研究提出CD34的表達與造血干細胞的細胞動力學相關,細胞激活時CD34+,細胞處于穩定狀態時CD34-;也有人提出CD34-造血干細胞較CD34+造血干細胞發育階段更早。我們認為：成人體內可能仍保留著一小部分原始間充質細胞，他們仍保留著多向分化能力，也能向造血干細胞分化，因此體內有CD34-造血干細胞和CD34+造血干細胞是正常的，CD34-造血干細胞較CD34+造血干細胞發育階段更早、更具造血潛能；但目前的用CD34+細胞代表造血干細胞的檢查方法已足以滿足臨床需要，因為臨床實踐已證明這一點。理論研究往往能推動學術發展，開發新技術，我們期待著造血理論的不斷發展給臨床帶來新技術，不斷提高臨床療效。

我們用CD34、CD38、HLA-DR三色組合測定了151份外周血經動員后標本，CD34+細胞占單個核細胞（MNC）的（0.954±0.466）%，含量為（3.55±2.41）×109/L；其中CD34+CD38-亞群含量為（0.253±0.24）×109/L，占CD34+細胞的7.13%；CD34+HLA-DR-亞群含量為（0.273±0.310）×109/L，占CD34+細胞的7.61%；隨著采集次數的增加，CD34+細胞及其亞群數量逐漸減少（P＜0.05）；隨著供者年齡增加，其外周血CD34+細胞數逐漸減少，在≥40歲供者CD34+細胞百分比和含量比＜20歲供者分別降低了47%和50%；動員后外周血CD34+細胞數存在性別差異，男性供者外周血CD34+細胞數較女性高23%。 

應用流式細胞儀測定造血干細胞雖具有快速、準確的特點，目前被廣泛采用。但應用中要特別重視質量控制，要建立一套完整質控方法以確保檢測的準確性。

 細胞凋亡研究

 細胞凋亡是細胞在基因控制下的有序死亡，在疾病發生、發展中有重要作用，因而研究細胞凋亡有重要意義。細胞凋亡檢測方法很多，應用流式細胞儀技術可根據細胞在凋亡過程中發生一系列形態、生化變化從多個角度對細胞凋亡進行定性和定量的測定。

1. 細胞形態變化：通過流式細胞儀測定細胞光散射的變化來觀察細胞凋亡。在細胞凋亡早期，細胞前向角光散射的能力顯著降低，90°角光散射的能力增加；在細胞凋亡晚期，前向角和90°角光散射的信號均降低。此方法特異性不強，目前使用較少。

2 細胞膜功能改變：
（1） 磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine PS）異位：正常情況下，PS位于細胞膜內層，細胞發生凋亡時PS從細胞膜內翻轉并暴露在細胞膜外層，是細胞發生凋亡的早期事件。PS與Annexin Ⅴ（一種具有強力抗凝作用的血管蛋白）具有高度親和力。應用流式細胞儀采用FITC- Annexin Ⅴ/PI雙染法進行細胞凋亡檢測，可同時描述三群不同狀態細胞：FITC- Annexin Ⅴ-/PI-細胞，即正常活力細胞；FITC- Annexin Ⅴ+/PI-細胞，即凋亡細胞；FITC- Annexin Ⅴ+/PI+細胞，即已死亡細胞。此種方法操作過程簡單，指標敏感，應用者越來越多。
（2） PI/Hoechst33342雙染法：Hoechst33342（HO）是一種DNA的特異性熒光染料，可通過完整細胞膜，應用PI/Hoechst33342可將細胞分為三群：正常活細胞（HO強/ PI-），凋亡細胞（HO弱/ PI-），（由于凋亡細胞發生DNA降解和丟失，導致HO熒光減弱），死亡細胞（HO弱/ PI+）。此種方法再結合凋亡細胞前向角光散射能力降低的特點，能更好地鑒定凋亡細胞，但HO須紫外光激發，由于很多流式細胞儀不配有紫外激光，故此法應用受限。
（3） 吖啶橙(AO)/溴化乙啶(EB)雙染法: AO是一種異染性熒光染料,可通過完整的質膜,它與核酸的結合主要是嵌入DNA雙鏈的堿基之間，其發射峰為530nm，呈綠色熒光。EB的理化特性與PI相似，不能通過完整質膜。應用AO/EB雙染法也可以將細胞分成三群：正常活細胞（AO強/ EB -），凋亡細胞（AO弱/ EB -），死亡細胞（AO弱/ EB +），原理與PI/Hoechst33342雙染法相似，不同的是AO/EB雙染法所的激發光是被廣泛使用的氬激光（488nm），而不須紫外光，其缺點是染色過程較復雜，且AO易污染設備管道，因此使用此法者較少。
（4） 放線菌素D(7-AAD)染色法：7-AAD是一種核酸染料，它不能通過正常質膜，隨著細胞凋亡、細胞死亡過程，質膜對7-AAD的通透性逐漸增加，結合細胞凋亡中DNA的有控降解，最后通過7-AAD標記DNA的強弱，將細胞分為三群：7-AAD強為死亡細胞，7-AAD弱是凋亡細胞，7-AAD-為正常活力細胞。此法具有染色快速、簡便、價格便宜等優點。另外，由于此法不破壞細胞膜，故還可聯合使用FITC、PE標記的膜蛋白,對特殊細胞群及亞群進行多色熒光分析(雖然AO/EB雙染法也不破壞被檢細胞膜,但由于AO及EB的發射光波譜分別與FITC和PE的發射光波譜相似，故AO/EB法不能與FITC和或PE聯合使用)。此法是應用核酸染料測定細胞凋亡的流式細胞儀法中十分實用的方法。

 3. 細胞器改變：  線粒體膜APO2.7蛋白表達：早期凋亡細胞的線粒體膜出現APO2.7蛋白表達，利用熒光標記的單克隆抗體，運用流式細胞術可以檢測早期凋亡細胞。

4 .DNA含量變化：
    主要是PI染色法，由于凋亡細胞DNA發生有序降解，被降解的低分子量DNA片段從變性細胞膜（經乙醇及透膜劑處理）漏出細胞外，使得凋亡細胞內的DNA含量減低，在流式細胞儀測定細胞DNA含量直方圖中G1峰前可出現亞二倍體峰，即所謂凋亡峰。通過測定凋亡峰百分含量，便可知凋亡細胞比例。此法簡便、快速，是目前常用的、經典的測量凋亡細胞的方法。此法存在問題：少量的正常的低DNA含量細胞、由于機械損傷產生DNA含量減低的壞死細胞、染色體丟失的分裂相細胞以及細胞碎片和微核等都可能出現在亞二倍體峰內。因此，此法的特異性較低。

5. DNA斷裂點標記：細胞凋亡時發生DNA斷裂,利用末端轉移酶(TdT)可以將dUTP標記到斷裂點上,稱作原位缺口末端標記（TUNEL）技術。此法有直接標記和間接標記兩種，前者的標記物是FITC-dUTP，后者的標記物是生物素(biotin)標記的dUTP,需要再用FITC標記的親和素(avidin)與生物素標記的dUTP結合，使標記反應倍增，故間接標記法靈敏度高，但操作較復雜。TUNEL還可以配合其它單抗同時進行細胞表型分析，或與DNA含量同時分析。TUNEL法因其靈敏度高而被廣泛采用。

6 細胞凋亡相關基因產物檢測：細胞凋亡是一個多種基因參與的復雜過程,目前已知與bcl-2基因、c-myc基因、P53基因等有關，這些基因都有相關產物，目前針對這些相關產物已有單克隆抗體生產，應用這些單抗，通過流式細胞儀可檢測造血細胞凋亡相關基因蛋白表達水平，相互關系。
    流式細胞儀測定細胞凋亡方法、層次眾多，且具有快速、準確特點，應用十分廣泛。在實際應用中應注意采用多種方法結合使用，使結果更加可靠準確。

細胞分選

 流式細胞儀能夠分選某一亞群細胞,分選純度＞95%。目前細胞分選主要用于研究，臨床應用較少。血液學應用最多的是造血干細胞的研究，最近隨著造血理論的深入研究關于造血干細胞究竟是否都是CD34+細胞出現一些爭論,實驗研究證明, CD34-造血干細胞較CD34+造血干細胞更具造血潛能,這些實驗研究所用的CD34- 和CD34+細胞就是通過細胞分選獲得的。小鼠造血干細胞分選一般按lin-c-Kit+CD34+/ lin-c-Kit+CD34-分選,人造血干細胞分選一般按lin-CD34+/ lin-CD34-分選。

為避免某些遺傳性血液病如海洋性貧血、異常血紅蛋白病的純合子出生，產前診斷非常重要，這些疾病的主要靶細胞是紅細胞，而孕婦血循環中存在著胎兒有核紅細胞，只是數量非常少，利用流式細胞儀可從孕婦血液中分選出胎兒有核紅細胞（分選條件：CD45-GPA+）進行基因分析，作出產前診斷。
利用流式細胞儀分選免疫擔當細胞進行細胞免疫學研究也是目前的熱門課題。總之，流式細胞儀能夠分選出你想得到的任何一亞群細胞，只要你想得到的某一亞群細胞有合適的單克隆抗體標記，流式細胞儀的分選功能將得到越來越多的科學研究和臨床應用。

其他

流式細胞儀可能在兩方面對骨髓增生異常綜合癥（MDS）有用，一是測定CD34陽性細胞數，以監測病情，二是測定核蛋白增殖因子（PCNA）,有報告PCNA再在生障礙性貧血、骨髓增生異常綜合癥、白血病三種疾病中表達有明顯差異，可輔助鑒別診斷。

此外流式細胞儀也可檢耐藥蛋白,如肺耐藥相關蛋白（LRP）、多藥耐藥蛋白（MRP）、 P170等。
流式細胞儀也可檢測細胞因子，細胞內細胞因子如白介素系列（IL-1—IL-14）,腫瘤壞死因子(TNF),干擾素(IFN)等,只要用適當的打孔劑即可用抗上述細胞因子單克隆抗體標記后用流式細胞儀測定。