摘　要　為探討急性情緒應激對大鼠曠場行為的影響,以及腦神經顆粒素(Neuroganin,NG)變化與應激性行為效應之間的相互關系。以急性不確定性空瓶刺激,建立情緒應激動物模型。將40只雄性SD大鼠隨機分為情緒應激組1(ES1,接受情緒應激和曠場測試)、情緒應激組2(ES2,只接受情緒應激)、正常對照組1(C1,無情緒應激,但接受曠場測試)和正常對照組(C2,無情緒應激,也無曠場測試) (n=10)。以曠場行為和高架十字迷宮任務來評定大鼠應激后的行為變化,Western印跡雜交法(Westernblotting)測定海馬和前腦皮層中的NG含量和磷酸化水平。結

果表明: (1)應激后ES1組的水平活動增加,與C1組比較,差異有顯著性, p<0. 01; (2) ES1組海馬和前腦皮層的NG磷酸化水平高于C1和C2組,差異有顯著性,均為p<0. 05; ES2組的前腦皮層NG的磷酸化水平高于C1組,差異有顯著性,為p<0. 05; (3)海馬的NG磷酸化水平與水平活動之間的相關達顯著水平。提示急性情緒應激能導致動物明顯的行為改變如焦慮,這種行為改變可能與腦內NG磷酸化水平的變化有關。水平活動可能是反映急性情緒應激的較敏感行為指標,海馬NG磷酸化水平可能是預測急性情緒應激所致焦慮或抑郁行為的較敏感生物學

指標。

關鍵詞　急性應激,情緒應激,海馬,前腦皮層,行為,神經顆粒素。

1　前言

　　迄今有關應激引起行為改變的腦機制,包括所涉及的物質分子、作用途徑和信號傳導方式所知甚少。以往的研究主要集中在神經遞質和調質及功能的變化,也有用c - fos為探針進行相關腦區的探索,但在應激改變行為的腦機制的認識上仍有許多謎團。近年來,國內外許多學者認為突觸可塑性的改變就是應激在中樞神經系統留下的生物學“痕跡”,它會引起腦功能和行為活動的改變。應激過程中,中樞突觸可塑性機制的變化是涉及情緒和行為障礙發生的重要中樞機制,包括突觸結構可塑性和突觸功能可塑性機制的變化。前者是指相關腦區的神經元的數量減少和細胞缺失、樹突棘萎縮等形態結構的器質性損害,其中海馬和前腦皮層是涉及應激的最為重要的腦結構。后者則是指蛋白信號傳導途徑缺陷、突觸傳遞效能障礙等,以中樞NR依賴性LTP的改變最受關注

　　由于中樞神經元特異性蛋白質及其磷酸化反應對維持突觸結構和功能,包括突觸的生長、發育、代償性變化和功能傳遞均具有十分重要的作用。所以,應激后某些中樞神經元特異性蛋白質的含量和磷酸化水平變化,可能通過參與突觸結構和功能可塑性機制的改變,涉及到應激所致行為效應的中樞機制。近期研究表明,某些表達于中樞神經元的蛋白質如熱休克蛋白70(Heat Shockprotein- 70, HSP- 70)、腦源性神經營養因子(brainderivedneurotro2phicfactor,BDNF)、膜生長相關蛋白(thepresynaptic43- kDa growth- associatedprotein, GAP- 43),與應激和某些精神障礙發生密切相關,使得研究者們開始關注突觸特異性蛋白質在應激反應的中樞機制中的可能角色。

　　神經顆粒素(Neurogranin, NG)是一種神經元特異性蛋白質,在與應激、情緒和行為密切相關的腦結構如皮質、海馬和杏仁核中高表達,是突觸后PKC的重要底物蛋白。研究發現,NG參與中樞NR依賴性LTP, PKC、PKA和CaMKⅡ等多種重要的蛋白信號傳導途徑,通過介導突觸強度的改變,構成誘發突觸可塑性表達的共同途徑的一部分,在突觸可塑性中具有關鍵作用。此外, NG能通過磷酸化水平的變化對中樞NR依賴性LTP過程產生明顯的影響,對某些應激源的反應敏感,并且與學習記憶密切相關。因此,它可能涉及到應激所致行為障礙的突觸結構和功能可塑性機制。研究發現,慢性生理應激和情緒應激能導致動物行為異常以及NG含量的顯著下降,并且異常行為與NG含量的相關達顯著水平。表明慢性應激后,NG含量下降是預測行為障礙發生的比較敏感的生物學指標,可能涉及慢性應激所致行為障礙的中樞機制。上述研究結果提示, NG可能作為一9: 00～9: 10和晚21: 00～21: 10給動物飲水,之后撤掉水瓶,其余時間不給水。定時喂水期結束后開始應激實驗, ES組動物在定時喂水時間內給予的空

瓶刺激誘發其情緒應激,刺激的給予是無規律的,但維持一天一次;應激共持續3天。C1和C2組不接受任何處理,在籠中飼養,自由飲水和攝食。所有動物在適應期開始、適應期末、定時喂水期末、應激第3天共稱四次體重以考察應激的程度。

2. 3　儀器和試劑

　　第一抗體抗NG總蛋白單克隆抗體、磷酸化NG多克隆抗體、β- Actin單克隆抗體、第二抗體辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體、山羊抗鼠IgG抗體、BCA(bicinchoninicacid)蛋白檢測試劑盒、全細胞裂解液(buffer)、硝酸纖維素膜(Nitrocellulosefilter,NC)均為Sigma公司產品,增強型化學發光系統(ECL)試劑盒購自美國Pierce公司。Gel. Doc凝膠成像半定量分析系統購自Bio- Rad公司。

2. 4　行為學測試

　　采用曠場測試和高架十字迷宮任務程序, ES1組和C1組動物在適應期末和應激期末共進行兩次行為測試。

2. 4. 1　曠場測試　將動物置于高50cm、直徑180cm、周邊和底面均為黑色的圓形曠場中,光照度為60lux,室內隔音。觀察者在行為實驗室內用攝像系統記錄動物在曠場內5min的行為表現,包括水平活動距離、直立、修飾、探究、呆滯和排便量。其中水平活動距離和探究通過行為跟蹤分析系統獲得數據,直立、呆滯、修飾行為是根據行為攝像儀統計發生的次數。每只動物的排便量是以曠場試驗結束后排便的顆粒數來表示。2. 4. 2　高架十字迷宮任務　裝置高50cm,開放吊臂為110cm×10cm×10cm(長×高×寬),閉合吊臂為110cm×50cm×10cm(長×高×寬)。測試于每天10∶00～14∶00h進行。在測試開始時,大鼠被放

至迷宮的中間平臺上,面對迷宮的同一個開放吊臂。

測試時間為5min,記錄4個行為指標。(1)進入迷

宮開放吊臂總次數, (2)在迷宮開放吊臂中停留時

間, (3)進入迷宮閉合吊臂總次數, (4)在迷宮閉合

吊臂中停留時間。

2. 5　海馬和前腦皮層NG的測定

　　應激實驗結束后次日,對ES1組和C1組大鼠進行行為測試后,立即快速斷頭處死所有大鼠,剝離海馬和相同體積的前腦皮層組織,前腦皮層組織是根據大鼠腦圖譜確定的正中線靠近前外側的前額葉皮層組織(如圖1所示M1和M2區域)。之后將組織迅速用液氮冷卻。

　　采用Western印跡雜交法(Westernblotting)測定大鼠海馬和前腦皮層的NG含量和磷酸化水平。將組織加入buffer勻漿。勻漿后加入BCA液搖勻,在37℃水浴箱中溫育30分鐘,通過蛋白質分光光度計進行樣品海馬和前腦皮層總蛋白質的初步定量,根據樣品總蛋白含量計算出每一樣品跑電泳所需加入的緩沖液量。勻漿中加入樣品緩沖液,走15%的聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉移至NC膜,NC膜以封閉液(10%脫脂奶粉,溶于TTBS)室溫封閉1h,用Tris/Tween緩沖鹽水(TrisbufferedTween- 20sa2line, TTBS)洗膜, 10min(3次。加入抗NG總蛋白單克隆抗體室溫孵育3h,再用TTBS洗膜, 10min(3次。TTBS液稀釋山羊抗兔IgG抗體(1: 4000)孵

育,室溫,振蕩1h,同樣洗膜3次。加入ECL熒光標記,以膠片曝光顯跡。之后,對同一張NC膜上的內參蛋白β- Actin和磷酸化NG進行雜交。通過Gel. Doc凝膠成像半定量分析系統對膠片上的NG蛋白、磷酸化NG和β- Actin蛋白條帶進

3　結果

3. 1　體重

　　適應期開始、適應期末、定時喂水期末和應激期末,四組動物的體重總體比較差異無顯著性(p>0105)。但在應激期內(從定時喂水期末到應激期末), ES1和ES2組動物體重增長非常緩慢。

3. 2　曠場行為測試

應激前,兩組動物在曠場測試中水平活動距離、直立次數、修飾行為、呆滯行為和排便量的比較差異無顯著性(p>0. 05)�！�應激后, ES1組表現出水平活動增加,與C1組比較,差異有顯著性(p<0. 01)。其余行為指標的比較差異無顯著性。