哮喘致敏小鼠模型的建立及脾臟 CD4+T細胞的分離

Establishment of sensitized asthma model in mice and CD4+T lymphocyte isolation from spleens

程曉明,王長征,李淑平,錢桂生(第三軍醫大學附屬新橋醫院全軍呼吸內科研究所,重慶 400037)

提 　要 : 目的 　建立一種可靠的哮喘致敏小鼠模型及分離脾臟 CD4+T細胞。方法 　采用卵蛋白致敏的方法建立模型 ,運用panning法分離 CD4+T細胞。結果 　此模型小鼠肺組織呈現典型的哮喘樣病理改變 ,其外周血、支氣管肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸性粒細胞百分比(EOS%)顯著高于正常對照組( P < 0.01) 。CD4+T細胞純度經流式細胞術(FCM)檢測 ,純度達 97.3 %。結論 　此方法建立的模型及分離的 CD4+T細胞可用于哮喘的實驗研究。

建立哮喘動物模型及分離高純度的 CD4+T細胞是實驗研究哮喘發病機制的重要前提。本實驗就小鼠致敏模型的建立及其脾臟 CD4+T細胞的分離方法進行介紹。

1 　材料與方法

1.1 　主要試劑及材料

1.1.1 　淋巴細胞分離液 　　將 9 % ficoll 400 溶液(Sigma 公司)和 33.9 %泛影葡胺溶液按比例混合 ,調比重至 1.090。

1.1.2 　尼龍毛柱的制備 　　稱取 80mg 尼龍毛 ,將其細致撕勻后裝入 2 ml 一次性注射器內 ,柱高約 4 cm。用 Hanks 液充分浸濕尼龍毛柱 ,使其內不留氣泡 ,高壓滅菌消毒。使用前用預溫至 37 ℃的 RPMI 1640(含 10 %胎牛血清 ,Fetal calf serum ,FCS)洗柱后封閉下端出口。

1.1.3 　CD8+單克隆抗體(Monoclonal antibody ,mAb)包被平皿的制備 　　取若干個聚苯乙烯平皿 ,將 CD8+mAb 溶液(北京邦定公司)100μl 加入平皿中 ,并加入 0. 05 mol/L 碳酸鹽緩沖液(pH9.5)3 ml ,混勻 ,室溫下無菌放置 40 min ,磷酸鹽緩沖液 (PBS,pH7.2)漂洗 ,加入含 1 % FCS的 PBS,室溫下無菌孵育 15 min ,PBS漂洗 ,4 ℃保存備用。

1.2 　實驗動物及分組

　　4～6 周健康 BALB/ c 小鼠 40 只 ,雌雄不限 ,體重 16～20 g ,由第三軍醫大學實驗動物中心提供。將小鼠隨機分為兩組 ,A組為正常對照組 ,以生理鹽水代替雞卵清蛋白 (Ovalbumin ,OVA , Grade Ⅱ, Sigma 公司) 致敏和激發小鼠 ;B 組為致敏模型組 ,給予 OVA致敏和激發。

1.3 　致敏小鼠模型的建立

分別于第 1 天、第 13 天經小鼠腹腔注射 OVA 10μg 和氫氧化鋁凝膠(Al(OH)3)20 mg混合液;第 25 天時 ,將每只小鼠單獨置于 5 L 密閉容器中 ,以 1 % OVA 進行霧化吸入激發 ,使小鼠暴露在 OVA 氣霧中 20～30 min 直至出現哮喘樣發作為止 ,持續 6 d。由 402 型超聲霧化器(上海合力醫用器械廠)提供霧化動力。

1.4 　外周血、支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage

fluid ,BALF)中嗜酸性粒細胞百分比 (percentages

of eosinophils ,EOS %)計數及肺組織標本留取

1.4.1 　外周血及 BALF中 EOS%計數 　　各組小鼠各 14 只最

后一次激發 24 h 后 ,經腹腔麻醉 ,行氣管切開 ,收集 BALF 5ml ,

針刺心臟取血約 0. 5～0. 8 ml。將全部液體離心 ,收集沉淀細

胞 ,加入紅細胞裂解液去除紅細胞。用 EOS 計數液行 EOS 計

數。

1.4.2 　肺組織標本留取 　　打開未經支氣管肺泡灌洗的各組各 6 只小鼠胸腔 ,觀察肺臟的大體改變 ,剪取部分肺組織 ,經10 %甲醛固定后切片 ,行 HE染色。

1.5 　CD4+T細胞的分離及鑒定

1.5.1 　CD4+T細胞的分離 　　打開小鼠腹腔 ,無菌取出脾臟放入冷 Hanks液中 ,將其捻碎并濾過 100 目無菌鋼網 ,收集脾細胞懸液加入到淋巴細胞分離液中 ,2 000 g 離心 30 min ,沿管壁輕輕吸出中間灰白色細胞層 ,重懸于含 10 % FCS的 RPMI 1640溶液中 ;按每 1 ×108個細胞加入尼龍毛柱中 ,37 ℃,5 %CO2孵箱中孵育 1 h;打開下端出口 ,使 T細胞懸液以 40～60 滴(Drop ,d)/ min 流出 ,用 RPMI 1640 溶液反復洗柱至洗脫液達 6～8 ml ,將細胞懸液按每 1 ×107個加入 CD8+mAb 包被的聚苯乙烯平皿中 ,并加入 RPMI 1640 溶液 2 ml ,混勻 ,4 ℃作用 70 min ,每 20 分鐘輕輕旋搖 1 次 ,沿平皿壁吸取細胞懸液并用 RPMI 1640 溶液輕洗 2 次 ,2 000 g離心 10 min ,收集的細胞懸液即 CD4+T細胞。經臺盼藍計數 ,細胞存活率 > 89 %。

1.5.2 　CD4+T細胞純度鑒定 　　采用流式細胞術(Flow cytom2etry ,FCM)鑒定 CD4+T細胞純度[1]。

1.6 　統計學分析        各組結果以 ?x ±s 表示 ,各組間比較采用非配對 t 檢驗。

2 　結果

2.1 　小鼠致敏模型的肺組織病理改變      致敏組小鼠的肺臟與正常對照組小鼠的肺臟相比體積明顯增大 ,表面腫脹 ,有多處形狀不規則的暗紅色充血區。切面有白色泡沫狀滲出物 ,并可見明顯的血管斷面。肺組織切片HE 染色可見支氣管及血管周圍有大量的炎性細胞浸潤 ,以EOS為主 ,肺間質及肺泡腔內也可見 EOS浸潤。細小的支氣管內可見粘液栓。氣道上皮多處斷裂 ,基底膜明顯增厚且形態不規則。細支氣管平滑肌發生肥厚性增生。

2.2 　外周血及 BALF中 EOS %

2.2.1 　外周血 EOS%　　致敏組小鼠外周血 EOS%(11. 0 ±2.7)與正常對照組(0.7 ±0.5)比較顯著增高( P < 0.01) 。

2.2.2 　BALF中 EOS%　　正常對照組小鼠 BALF 中幾乎沒有EOS(0.0 ±0.01) ,致敏組小鼠 BALF 中 EOS%(21. 9 ±4. 4) 與正常對照組比較顯著升高( P < 0.01) 。

2.3 　CD4+T細胞純度鑒定結果

經 FCM檢測 ,CD4+T細胞的純度為 97.3 % ,見圖 1。

圖 1 　FCM檢測 CD4+T細胞純度

3 　討論

　　本實驗建立的 BALB/ c 小鼠致敏模型病理表現為:肺臟明顯水腫 ,細、小支氣管內有多量的粘液栓 ,氣道上皮斷裂、脫落 ,基底膜增厚 ,支氣管及肺血管周圍有以 EOS為主的大量炎性細胞浸潤 ,與哮喘的病理學特點相似 ;同時 ,此模型小鼠外周血及 BALF中 EOS %顯著增加 ,與哮喘患者外周血及 BALF 中 EOS %的改變一致 ,說明此模型可用于哮喘的實驗研究。

　　Panning 法又稱洗淘法。它是運用抗原與抗體相結合的原理進行細胞分離的一種方法 ,具有簡便 ,經濟、細胞完整性好等特點。國外在 90 年代早、中期即將這種方法廣泛用于實驗中。隨著科學技術的不斷進步 ,目前國外用于分離細胞的方法主要是磁珠分離法[2]和流式細胞儀法[3],但其造價昂貴 ,在國內并不能

普遍開展 ,故運用 Panning 法分離細胞仍不失為一種高效、經濟的方法。本實驗用 Panning 法分離的 CD4+T細胞經 FCM檢測 ,純度高 ,完全可用于進一步的實驗研究。

　　關鍵詞 : 哮喘 ;模型 ;小鼠 ;CD4+T細胞

中圖法分類號 : R - 332;R562.25 　　　文獻標識碼 : B

參考文獻 :

[1] 沈關心 ,周汝麟. 現代免疫學實驗技術[M]. 武漢:湖北科學技術出版社 , 1998.180 - 183.

[2] Holmes B J , MacAry P A , Noble A , et al. Antigen2specific CD8+T cellsinhibit IgE responses and interleukin24 production by CD4+Tcells[J ]. EurJ Immunol ,1997 ,27(10) :2 657 - 2 665.

[3] Denkers E Y, Scharton2Kersten T, Barbieri S, et al. A role for CD4+NK1.1 + T lymphocytes as major histocompatibility complex class Ⅱinde2pendent helper cells in the generation of CD8+effectorsfunction against in2tercellular infection[J ]. J Exp Med ,1996 , 184(1) : 131 - 139.

(編輯 　陳聰連)