呼吸道合胞病毒(RSV)是人類上呼吸道感染(URI)最重要的感染病原之一，尤其是兒童。RSV大約引起兒童90％的支氣管炎，幾乎所有嬰幼兒在生后頭3年都感染過RSV[1]。因此，進行RSV感染引起咳嗽的研究具有重要意義。目前認為，咳嗽反射敏感性(CRS)異常增高是機體咳嗽反應的一個十分重要的原因。O’Connell等L21的臨床研究發現，URI引起的咳嗽患者CRS升高是其主要特征，并不伴氣道反應性(AR)增高。但是，迄今為止，有關感染后咳嗽的真正機制知之甚少，還未見到RSV感染引起咳嗽的動物研究，病毒感染往往伴發AR升高，那么AR是否在感染后咳嗽中起關鍵作用呢?

    辣椒素受體亞型1(vanilloid receptor-1，VRl)是瞬時受體電位通道蛋白的超家族的成員之一。有研究發現慢性咳嗽患者VRl顯著高于健康者；而且，CRS與支氣管黏膜的VRl表達呈高度相關；氣道平滑肌VRl的表達也增強。表明VRl參與了慢性咳嗽的發病過程[3]，但病毒感染后VRl如何改變目前還缺乏研究。有研究發現，RSV感染可以引起標記呼吸道總神經纖維分布的蛋白基因產物9．5(protein gene product一9．5，PGP一9．5)的分布及表達

水平改變[4]。本研究將通過動態觀察與咳嗽有關的CRS、AR、VRl和PGP一9．5蛋白的變化，探討RSV引起咳嗽，尤其是感染后咳嗽的發病機制。

1材料與方法

1．1

主要實驗儀器和試劑    胎牛血清及MEM、DMEM／F12培養基購自美國Gibco公司，辣椒素購自美國Sigma公司，VRl鼠抗單克隆抗體均購自英國Abcam公司。HRP標記免疫組化二抗購自美國Invitrogen公司。單腔非限制型小動物體描儀購自美國Buxco公司，Leica DM4000智能型生物顯微鏡購自德國Leica公司。

1．2細胞培養和RSV的培養、收獲及定量    人喉癌上皮細胞株(Hep一2)和RSV病毒株均來源于美國ATCC，Hep一2細胞是對RSV敏感的細胞，用于病毒株的傳代培養。當Hep一2細胞在培養瓶中長至70％～80％融合后，取病毒懸液接種于細胞上，每15分鐘搖動1次，吸附2 h后倒出病毒液，加入2％胎牛血清的培養基，于第2～3天開始出現細胞病變，待病變達50％～60％時收獲病毒，將細胞反復凍融2～3次后lO000 r／min，4℃，離心20 min，去除細胞碎片，收集上清分裝后液氮中凍存。空斑技術測定病毒感染滴度，以空斑形成單位(pfu)來表示病毒感染滴度。

1．3動物分組、飼養、病毒接種和哮喘模型制作    雄性純白SPF級豚鼠來自廣東省實驗動物中心，體質量250～300 g。隨機分成5組，即正常對照組和4個病毒感染組。病毒感染組按病毒感染后天數又分為感染后6、12、28和42 d四個組。每組10只。SPF級環境下飼養，感染組動物單獨飼養，在適應新的環境1周左右后開始接種病毒。病毒滴鼻：乙醚麻醉后，兩側鼻孔分別滴入75“l的事先擴增凍存好的病毒液，病毒滴度為3．72×105 pfu。哮喘模型制作：腹腔內注射含5％雞卵自蛋白和10 g／L氫氧化鋁混合液1 m1致敏，15 d后予卵白蛋白吸人誘發哮喘發作。

1．4豚鼠CRS的測定通過辣椒素咳嗽激發試驗判斷氣道的CRS。其原理是通過霧化吸入特異性的刺激物，激活氣道感覺神經末梢的咳嗽感受器，誘發咳嗽的產生，以激發物的濃度和咳嗽程度判斷CRS。辣椒素是紅辣椒的刺激成分提取物，因為其安全、劑量依賴性和可重復性好，所以很適合用作CRS的評價。用單腔非限制型小動物體描儀測定豚鼠的CRS，各組動物分別在預定時間進行辣椒素咳嗽激發試驗，判斷CRS的指標主要是咳嗽總次數(CCnt)，方法參照Lewis等口1的研究所描述的。辣椒素激發溶液濃度為50弘mol／L，總量為1 ml，觀測記錄10 min(含霧化時間)內的CCnt。

1．5

豚鼠氣道高反應性(AHR)的測定     CRS測定后12 h，用Buxco無創肺功能儀檢測豚鼠的增強呼氣間歇(enhanced pause，Penh)。測定100弘l倍增濃度的乙酰甲膽堿(MeCh)霧化激發后Penh的變化，激發濃度由低到高，依次為100、200、400、800、1 600 mg／L，記錄各濃度級MeCh激發下的Penh平均值。將每個MeCh激發濃度下的Penh值轉換為與生理鹽水激發時Penh值的百分比，以Penh％表示，作為AHR的評價指標。

1．6

Real—time PCR方法檢測肺組織VRl的mRNA相對表達    Primer5．o設計的RSV引物序

列如下：VRl正義引物：5’一TCAAAGACCC—GGAAACAGGG一3’，反義引物：5’一CTCTACCA—GGAGGGTCACCA一3’，產物224 bp；GAPDH(內參照)正義引物：57一TGGTGCCAAAAGGGTCA一3’，反義引物：5’一CCTCCACAATGCCGAAGT一3’，產

物176 bp。提取組織總RNA。采用2一心、相對定量法來計算VRl mRNA的表達水平。

1．7免疫組織化學方法檢測豚鼠肺組織VRl和PGP．9．5蛋白的表達及免疫組化結果圖象分析(半定量方法)

DAB染色免疫組化圖片用Leica顯微鏡觀察、拍照，進行蛋白表達強度(灰度)的比較。根據以下染色深淺行半定量分析：0=無染色；1一輕度著色；2一中度著色；3一強著色；4一很強著色(幾乎呈黑色)。每張片子至少隨機分析5個高倍視野。所有片子均由2個不知情的人分析。

1．8統計學處理    采用SPSS 16．o統計軟件進行分析，數據以z±s表示。因樣本數不多，標準差偏大，各組間總體檢驗采用非參數經驗Kruskal—Wallis法，組間比較采用Bonferroni的組問比較檢驗法。P<o．05為差異有統計學意義。

2

結果

2．1

豚鼠CRS測定結果感染后6、12、28和42 d組豚鼠CRS分別為：(8．oo±3．86)、(8．70±6．20)、(7．60±4．40)和(6．70土3．71)CCnt，均較正常對照組[(2．50±1．43)CCnt]升高(P<o．05)，以感染后12 d組升高最為明顯(P<0．01)；而哮喘組CRS為(3．90土1．60)CCnt，與正常對照組比較差異無統計學意義。

2．2豚鼠AR的改變

圖1結果顯示，急性感染后12 d組豚鼠AR對2個高濃度MeCh刺激結果是(1 069土156)％和(1 846±285)％，均高于正常對照組(P值分別<0．05和o．01)。雖然其他感染組部分豚鼠AR也有一些不同程度的增高，尤其是第28天組，但由于個體差異大，整體與正常對照組相比差異無統計學意義。而哮喘組豚鼠與正常對照組相比均有明顯AHR。

注：哮喘組與正常對照組比較。aP<0．05，6P<0．01；感染后12 d組與正常對照組比較，cP<0．05。6P<0．01

圖l

呼吸道合胞病毒實驗豚鼠氣道高反應性的改變(H一8)

2．3

Real—time PCR方法檢測肺組織VRl mRNA相對表達結果表1顯示RSV感染后6、12和28 d組VRlmRNA表達分別為：1．57士O．43、1．61±0．47和1．68±o．56，均高于正常對照組(P值均<O．05)，而以感染后28 d組為最高。

2．4

VRl和PGP一9．5蛋白的免疫組織化學結果見圖2及表2(單位以灰度表示)。與正常對照組相比，病毒感染組豚鼠肺組織可見深黃色陽性反應物。表達強的陽性反應顆粒顏色較深，陽性反應細胞數量也顯著多于正常對照組。感染后28 d組VRl表達為2．14(1．00)，較正

注：VRl：辣椒素受體亞型1；A：完全正常的免疫組化結果；B：VRl強表達；C：PGP-9．5強表達

圖2    VRl和PGP一9．5蛋白的免疫組化結果DAB染色×400

常對照組[1．14(o．oo)]增強(P<0．05)。感染后12 d組PGP一9．5表達為2．29(1．00)，較正常對照組增強(P<O．05)。

3討論

    眾所周知，病毒感染引起的咳嗽是急性咳嗽的最常見原因，而病毒感染后咳嗽一般為亞急性咳嗽，時間為3～8周，在亞急性咳嗽中占絕大多數，因此本實驗選擇了感染后6、12、28和42 d作為觀察時間點。本研究發現所有感染組豚鼠的CRS均較對照組明顯升高，亞急性階段甚至還高于急性咳嗽階段。因此，本研究的特點類似0’Connell等比研究中的臨床呼吸道感染咳嗽患者，說明CRS的升高可能是病毒感染引起咳嗽的主要特點。病毒感染導致了機體的咳嗽反應增加的機制涉及到病毒引起的氣道炎癥，改變了控制氣道的傳入和傳出神經，最終引起持續的咳嗽；或者是因為炎癥介質引起咳嗽有關的感受器致敏。

    哮喘也是咳嗽的一個常見原因，咳嗽可以作為典型哮喘的前身或作為其單獨的主要癥狀，即我們所熟悉的咳嗽變異性哮喘(CVA)。CVA同感染后咳嗽很相似，但是它們存在2種完全不同的機制，CVA是由于氣道平滑肌的痙攣引起，對支氣管擴張劑敏感，而CRS正常L”⋯。而后者正如O7Connell等心1的研究發現的，則是因為CRS的升高。因為多數這些臨床患者可以提供URI的病史，說明有可能是他們的咳嗽感受器在URI后變得持續敏感。因此，URI可能是通過引起辣椒素敏感的氣道傳入神經的敏感性增加而引起感染后咳嗽，伴或不伴氣道直徑或反應性的變化。

    目前認為病毒感染因為破壞了氣道上皮，與咳嗽密切相關的C神經纖維末梢裸露；然后刺激物引起神經末梢釋放各種神經肽，不僅直接使CRS增加，并且通過活化膽堿能神經纖維釋放乙酰膽堿。RSV感染引起的氣道病理生理改變及相關的臨床癥狀除了與病毒復制直接損傷相關外，更主要的是由于感染誘發了大量的細胞兇子和炎癥介質釋放而引起的氣道免疫炎癥損傷和異常修復過程。同時，病毒感染通常可以通過引起多種氣道炎癥因子的釋放等機制，引起AR的升高。本研究中發現RSV感染導致了豚鼠CRS持續增加，同時也引起了感染組AR均有不同程度的提高。但總的說來，AR的升高與CRS的升高不平行，亞急性咳嗽階段AR升高不明顯，而后者甚至更高；哮喘組豚鼠雖然有氣道痙攣，每個MeCh濃度均有明顯AHR，但對辣椒素刺激的CRS并不隨之增加。因此，在感染急性期的急性咳嗽中可能有氣道痙攣參與，但在感染后咳嗽階段可能關系不大，也可以說，在感染后咳嗽中AR的增高是伴發的，在其發病機制中并不起決定作用，如果給予支氣管擴張劑為主的治療可能沒有太大意義。Pounsford等u叫報道支氣管擴張劑能明顯緩解支氣管痙攣引起的哮喘患者的咳嗽反應，但對正常人的咳嗽反應沒有影響；而Fujimura等凹]證明美喘清對CRS沒有影響，而且吸入乙酰膽堿引起支氣管痙攣但也不能增加CRS。哮喘患者吸入鹽水、變應原前后的CRS差異無顯著性，咳嗽閾值和氣道嗜酸粒細胞性炎癥、AHR均沒有關聯L8]。如支原體肺炎一樣，盡管咳嗽癥狀明顯，但CRS均沒有明顯增高‘引。

    氣道炎癥引起的組織充血、水腫及細胞變性、壞死等改變可在局部形成一個含質子的低pH和中熱的環境，使咳嗽受體的興奮性增加，合成更多的VRl。多種炎性介質也能直接致敏VRl受體，形成惡性循環，因此病毒感染引起的氣道炎癥可通過VRl等神經遞質的變化，最終使咳嗽感受器發生功能性改變。本文VRl基岡表達的動態結果顯示，其mRNA水平在感染后均明顯上調，在28 d組達到高峰；而在28 d組VRl的蛋白表達也明顯增強，正是引起感染后亞急性咳嗽的時間。因此說明了VRl可能與RSV感染引起感染后咳嗽的發病機制

有關。有研究發現，RSV的持續感染誘發了P物質和PGP的增加，改變了氣道的神經分布類型，甚至引起了重塑性變化，因此與氣道功能的持續改變有關|。本研究中發現RSV感染后，代表呼吸道總神經纖維，也包括支配神經肽SP亞群的神經纖維分布的PGP一9．5，在感染后12 d組的表達明顯增強；其他時間組的表達雖有所增強，但無統計學意義，因此需要更多的重復實驗。但目前結果至少表明RsV感染后可能存在氣道神經纖維分布和構成的改變，其結果可能導致與咳嗽相關的神經功能的改變，因此提示了一些研究所提到但沒有證明的病毒感染性咳嗽的關鍵機制，將可能對未來的治療產生一定的指導意義。

    總之，豚鼠RSV感染后出現了CRS的明顯增加，與URI咳嗽患者的臨床特征一致，并伴隨感染后急性期第2周的AR明顯增高。感染后VRl的mRNA水平出現明顯上調，28 d組的蛋白表達也明顯增強。感染后12 d組PGP一9．5的蛋白表達明顯增強。表明RsV感染后引起的氣道功能及相關神經遞質的變化可能與病毒感染性咳嗽，尤其是感染

后咳嗽的發病機制有關。