細胞凍存和復蘇

細胞凍存后可保存種子細胞，以便隨時取用；減少細胞被微生物污染的危險性；減少細胞之間交叉污染的危險性；減少細胞因傳代培養而引起的遺傳變異和形態改變；避免有限細胞系出現衰老或惡性轉化。凍存細胞前，應對細胞進行鑒定并檢查是否被污染。

細胞凍存及復蘇的基本原則是“慢凍快融”，這樣可以最大限度的保存細胞活力。目前細胞凍存多用甘油或二甲基亞砜（DMSO）作為保護劑，這兩種物質能提高細胞膜對水的通透性；緩慢冷凍可使細胞內的水分滲出細胞外，減少細胞內冰晶的形成，從而減少冰晶對細胞的物理損傷。復蘇細胞采用快速融化的方法可以保證細胞外結晶在很短的時間內融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內形成胞內再結晶對細胞造成損傷。需要特別注意的是DMSO 稀釋時會釋放大量熱量，因此DMSO 不能直接加到細胞液中，必須事先配制。

• 細胞凍存

1. 細胞凍存前12-24h，換新鮮培養基，使細胞一直處于對數生長期。
2. 待細胞長至80%匯合時胰酶消化，用新鮮培養基吹打后制成細胞懸液，1000rpm離心10min。懸浮細胞則直接離心。
3. 棄上清，加入凍存液重懸細胞沉淀，調整細胞濃度為3×10^6-1×10^7cells/mL。將細胞懸液分至凍存管內，每管1-1.5mL，擰緊蓋子。在管壁上做好標記，標明細胞名稱、凍存日期等。
4. 按下列順序依次降溫：室溫→4℃ 20min →-20℃ 30min →-80℃過夜→液氮保存。也可使用程序降溫盒更為方便，細胞凍存管放入程序降溫盒內可直接放入-80℃過夜，再轉至液氮罐內。注意程序降溫盒內異丙醇的量必須高于最低刻度線；凍存5次后異丙醇需要更換一次，以免影響凍存效果。
5. 細胞凍存后應取出一管復蘇，檢測細胞的存活率。理論上細胞可在液氮內長期保存，為穩妥起見可在細胞凍存半年后復蘇培養，觀察細胞生長情況，再繼續凍存。

• 細胞復蘇

凍存細胞十分脆弱，必須輕柔操作。除少數對冷凍保護劑（DMSO或甘油）敏感的細胞，絕大部分細胞在解凍之后，可直接接種到完全培養基中，隔天再換新鮮培養基以去除DMSO 和死細胞，如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼壁的問題，也可因不離心，減少了操作步驟，降低污染的幾率。

1. 將凍存細胞從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴鍋中快速解凍，輕輕晃動凍存管，使細胞能在1-2min內完全解凍，盡快通過最易受損的溫度段（-5-0℃）。注意凍存管管口不能沒入水中，避免引起污染。
2. 用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺內，將管內細胞轉移至裝有完全培養基的離心管內制成細胞懸液。進行活細胞計數，調整細胞濃度至少為3×10^5個活細胞/mL。
3. 將細胞懸液轉移至T25細胞瓶內，補加適量的培養基，輕輕晃動細胞瓶使細胞分布均勻，放入溫箱內培養。
4. 第二天觀察細胞貼壁生長情況，換新鮮培養基以去除DMSO和死細胞。繼續培養，待細胞長至80-90%匯合時正常傳代。一般剛復蘇的細胞需經過2-3次傳代，細胞活力恢復后才能進行后續的實驗。