大腸桿菌感受態細胞的制備及轉化方法！
 
一、實驗目的
通過本實驗，掌握大腸桿菌感受態細胞的制備及轉化的方法和技術。
 
二、實驗原理
細菌處于容易吸收外源DNA 的狀態叫感受態。轉化是指質粒DNA或以它為載體構建的重組子導入細菌的過程。其原理是細菌處于0℃，CaCl2低滲溶液中，菌細胞膨脹成球形。轉化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復合物粘附于細胞表面，經42℃短時間熱擊處理，促進細胞吸收DNA復合物。將細菌放置在非選擇性培養基中保溫一段時間，促使在轉化過程中獲得的新的表型（如Ampr等）得到表達，然后將此細菌培養物涂在含有氨芐青霉素的選擇性培養基上。
 
三、實驗儀器與設備
⒈超凈工作臺
⒉低溫離心機
⒊恒溫搖床
⒋恒溫箱
⒌-70℃
⒍恒溫水浴器
 
四、實驗材料
⒈氯化鈣(CaCl2)
⒉胰蛋白胨
⒊酵母提取物
⒋氯化鈉(NaCl)
⒌氨芐青霉素
⒍大腸桿菌DH5α
⒎pUC19質粒
⒏50ml離心管
⒐吸頭、培養皿、錐形瓶等。
 
附試劑的配制：
⒈0.1mol/L CaCl2溶液
⒉LB液體培養基
配制每升培養基，應在950ml去離子水中加入：
胰蛋白胨（bacto-typtone） 10g
酵母提取物（bacto-yeast extract） 5g
NaCl 10g
搖動容器直至溶質完全溶解，用NaOH調節pH至7.0,加入去離子水至總體積為1L,121℃濕熱滅菌20min。
⒊氨芐青霉素（Amp）,用無菌水配制成100mg/ml溶液，置-20℃冰箱保存。
 
五、實驗步驟
⒈從大腸桿菌DH5α平板上挑取一個單菌落接于2ml LB液體培養基的試管中，37℃振蕩培養過夜。
⒉取0.5 ml菌液轉接到一個含有50ml LB液體培養基錐形瓶中, 37℃振蕩培養2-3h.(此時,OD600<=0.5,細胞數務必<108/ ml,此為實驗成功的關鍵).
⒊將菌液轉移到50 ml離心管中,冰上放置10min.
⒋離心10min(4000rpm),回收細胞.
⒌倒出培養液,將管倒置1min以便培養液流盡.
⒍用冰冷的0.1mol/L CaCl210ml懸浮沉淀,立即放在冰上保溫30min。
⒎0-4℃6000rpm，離心10min，回收細胞。
⒏用冰冷的0.1mol/L CaCl22ml懸浮細胞 。（務心放冰上）
⒐分裝細胞，每200μl一份。此細胞為感受態細胞。
⒑取200μl新鮮配制的感受態細胞，加入DNA 2μl（50ng）混勻，冰上放置30min。
同時做兩個對照管：
受體菌對照：200μl感受態細胞+2μl無菌水
質粒對照：200μl 0.1mol/L CaCl2溶液+2μl質粒DNA溶液
⒒將管放到42℃循環水浴1-2min。
⒓冰浴2min.
⒔每管加800μl LB液體培養基，37℃培養1h(慢搖)。
⒕將適當體積已轉化的感受態細胞，涂在含有氨芐青霉素的固體培養基上。
⒖倒置平皿37℃培養12-16h，出現菌落。
 
六、作業
觀察在含氨芐青霉素的瓊脂糖平板上生長的菌落生長情況，并分析原因。
 
七、實驗安排
15學時
第1天下午—第2天上午：配LB培養基，接種，液體培養
第2天上午、下午：繼續培養2-3h,制備感受態細胞，轉化，培養12-16h
第3天上午：觀察結果