如今,單克隆抗體藥物以其獨特的作用機制及高效性,在腫瘤和自身免疫疾病的治療中發揮了不可估量的作用,成為全球的研發熱點，目前已有2400個單克隆抗體藥物處于研發及商業化階段。
 

1975年雜交瘤技術問世^[1]。1986年鼠源單克隆抗體藥物Muromonab的上市拉開了單克隆抗體發展的序幕。隨后的50年，單克隆抗體藥物經歷了嵌合抗體-人源化抗體--全人源抗體四個階段，產生了抗體偶聯藥物、抗體融合蛋白、單域抗體等多種新型抗體藥物，標志著免疫療法黃金時代的開啟^[2]。單克隆抗體藥物的推陳出新歸根于單克隆抗體技術的不斷發展與創新。目前應用的抗體技術有：雜交瘤技術、噬菌體展示技術、天然全人源庫技術和單個B細胞技術。

單個B細胞抗體制備技術原理

單個B細胞技術^[3]是近年來新發展的一類快速制備單克隆抗體的技術，是根據每一個B細胞只含有一個功能性重鏈可變區DNA序列和一個輕鏈可變區DNA序列，以及每一個B細胞只產生一種特異性抗體的特性，從免疫動物組織或外周血中分離抗原特異性B細胞，通過單細胞PCR技術從單個抗體分泌B細胞中擴增IgG重鏈和輕鏈可變區基因，然后在哺乳動物細胞內表達獲得具有生物活性的單克隆抗體。這種方法保留了重鏈和輕鏈可變區的天然配對，具有基因多樣性好、效率高、全天然源性的特點，也成為了目前快速開發針對抗病毒感染性疾病抗體的重要策略。
 

 單個B細胞抗體制備過程

圖1  單個B淋巴細胞抗體制備過程^[4]
 

 1. 鑒定和分離單個B細胞
 

1）溶血斑塊技術分選B細胞

溶血斑塊技術原理^[5]是抗原與抗體反應后，在補體作用下能使紅細胞裂解形成溶血斑塊，進而通過顯微技術篩選和分離抗原特異性B細胞。該方法有點：方便、快捷、特異性好；缺點：紅細胞容易受到溫度、滲透壓、酶等多方面影響，且溶血斑塊技術分離的B細胞往往不能進行高通量分析和活細胞增殖。

 

圖2  克隆單細胞免疫球蛋白V_H和V_LcDNAs產生特異性抗體的策略^[5]

 

2）MACS法（磁珠分選法)分選B細胞
 

原理是基于抗原抗體結合的特異性，B細胞表面分子與包被有特異性抗體的磁珠相結合，形成表面分子-抗體-磁珠復合物，在外加磁場中，通過抗體與磁珠相連的細胞被吸附而滯留在磁場中，不能與特異性抗體相結合的細胞由于沒有吸附磁珠，不在磁場中停留，從而使細胞得以分離^[6]。該方法優點：操作簡單、穩定、重復性好；缺點：用到的抗體種類較多、對磁珠與磁珠柱的質量要求較高、費用較高。該方法可以和其它分離方法配合使用。
 

 

3）微雕刻和ISAAC方法分選B細胞

微雕刻技術原理^[7]是基于軟光刻微陣列芯片識別、克隆抗原特異性B細胞的方法。通過刺激多克隆B細胞，并將其逐個分布到芯片孔內進行培養產生抗體，然后將改芯片孔內抗體轉印至相應的蛋白芯片，通過與目標抗原反應后，再與熒光抗體反應，最后根據熒光抗體染色結果，通過顯微操作將分泌特異性抗體的B細胞轉移到細胞培養皿中進行后續克隆操作或抗體基因擴增。ISAAC(芯片免疫斑點微陣列測定)^[8]，是微雕法的延伸，是用包被于芯片表面的抗IgG抗體替代了抗體轉移過程，并且能在同一塊芯片上研究針對多種不同目標抗原的特異性抗體，并分離多種抗原特異性B細胞。這兩種方法優點：高通量、高特異性、高靈敏度；缺點：芯片陣列的構建價格較高、芯片上抗體包被比較復雜。
 

圖4  ISAAC技術檢測單個抗體分泌細胞^[8]
 

4）FACS法分選B細胞
 

FACS法原理^[9]是基于抗原抗體的特異性反應，利用熒光素標記的B細胞表面分子的抗體，以及標記的特異性抗原，通過多色流式分析與分選的方法，篩選抗原特異性B細胞。FACS分選可以將單個抗原特異性B細胞分選入細胞培養板的單孔中，直接進行抗體基因的擴增與測定。該技術是目前應用較廣泛的一種方法。優點：分離B細胞快速、準確、大量、多參數同時分析；缺點：費用高、通電磁場對細胞有一定損傷，會影響細胞活性。

 

(A) 傳感器的流體力學聚焦和振動產生的液流斷裂成液滴，其含有已被熒光標記抗體染色的細胞。(B) 通過激光掃描液滴，并對信號進行處理以給出“分類決策”（如果液滴含有綠色熒光細胞，則將進行充電并相應分類）。(C)當液滴脫落時，施加電荷。(D) 含有目標細胞的帶電液滴由靜電場引導進入指定的收集管完成分類。

 

5）微流控技術分選B細胞
 

結合微流控設備和芯片的技術是目前主流的商業化單B細胞平臺。BLI公司（Berkeley Lights，Inc）的Beacon單細胞光導系統受到多家大型藥企的青睞。Beacon平臺是通過微流控系統將分泌抗原特異性抗體的細胞輸送到芯片部位，并通過光電定位技術OEP將單細胞分離到芯片的各個小室中。而后采用基于磁珠的雙色熒光結合實驗檢各細胞的分泌物，分泌抗原特異性抗體的細胞會產生熒光信號，被儀器識別，單個陽性細胞通過OEP技術被導出輸送到96孔板中，進行進一步的測序、表達。該系統集單細胞分選和檢測及分析為一體，靈敏度和準確度高。

 

 

2. 擴增和克隆抗體基因

通常通過FACS法分離抗原特異性B細胞后，將其分選至含裂解液的96孔板中，裂解B細胞并釋放細胞內RNA。隨后通過RT-PCR、巢式PCR得到抗原特異性單個B細胞抗體可變區基因。

3. 表達、篩選和鑒定抗原特異性抗體

FACS分選的單個B細胞抗體基因擴增、載體構建、抗體表達及活性驗證是必要步驟。表達系統常用的是原核表達系統（例如大腸桿菌）或真核表達系統。在大腸桿菌中，通常表達抗體的抗原結合片段（Fab),而在哺乳動物中，可以表達完整的IgG分子。抗體生物活性驗證主要通過ELISA、間接免疫熒光、中和試驗等常規方法來驗證；除此之外，還可以通過流式分析法、免疫共沉淀、空斑法、空斑減少中和試驗等方法來驗證。

 

單個B細胞抗體制備技術應用

單個 B 細胞抗體技術制備的單克隆抗體在抗病毒治療、神經性疾病治療、免疫疾病治療等方面顯出了獨特的優勢和良好的應用前景。

1. 抗病毒治療應用

許多單B細胞抗體對病毒的治療正在臨床試驗階段中。HIV引起獲得性免疫缺陷綜合征，全球已有6390萬人感染，通過單B細胞技術已獲得5種抗HIV包膜蛋白的抗體(3BNC117; 10-1074; VRC01; PGT121；N6)正在臨床I/II 期實驗中進行評價。利用單個B細胞抗體技術，從治愈后的患者血液中分選抗體分泌的單個B細胞，快速鑒定和表達抗體基因，特別是對于新型病毒的治療和預防有很大幫助。

2. 神經性疾病治療應用

偏頭痛是全球第三大最常見疾病和第六大致殘性疾病，這是一種常見的慢性神經血管性疾病。2020年2月21日，Lundbeck宣布其偏頭疼藥物Vyepti（eptinezumab，兔抗體藥物）獲得美國FDA批準上市。Vyepti是由單B細胞技術制備的兔抗體藥物，靶向結合降鈣素相關基因肽（CGRP）配體，阻斷其對受體的結合作用。其II期臨床結果顯示許多患者的偏頭痛天數可以減少75%。此外，該公司的另一種偏頭疼藥物ALD1910正處于臨床前研究階段。

3. 免疫疾病治療應用

單個 B 細胞抗體制備技術能夠分離到人體內任意時期的B細胞，使得詳細深入地研究人體免疫系統各個階段功能和機理成為可能。對于自身免疫性疾病和其他免疫系統疾病治療抗體研究有良好的應用前景。
 

雖然，單個B細胞抗體制備技術具有效率高、全人源、基因多樣性更豐富等優勢。但2020年之前的10年中FDA尚未批準任何該方法制備的抗體藥物，且仍有一些不足，還有要不斷克服和完善。全人抗體開發成為近期藥物開發的趨勢，多種抗體技術的結合也將產生更多有效藥物，在醫藥領域極具前景。
 

百奧賽圖引入Beacon®單細胞光導系統，將分離和鑒定產生抗體的原代B細胞的工作在不到一天的時間內完成，結合自主開發的全人抗體RenMab小鼠，能夠快速高效獲得全人抗體，建立一站式抗體藥物開發平臺。百奧賽圖將通過“千鼠萬抗”計劃,打造全球創新藥物發源地，助力合作伙伴加快藥物研發進程。

 

圖 7  百奧賽圖RenMab小鼠+Beacon平臺加速抗體發現過程

 

參考文獻
 

[1] Kohler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity[J]. Nature, 1975, 256(5517):495-497.

[2] 高倩, 江洪, 葉茂, 等. 全球單克隆抗體藥物研發現狀及發展趨勢[J]. 中國生物工程雜志, 2019(3):111-119.

[3] 向軍儉, 童吉宇, 王宏. 抗體技術研究進展(1):人源抗體技術[J]. 暨南大學學報:自然科學與醫學版, 2012(05):92-98.

[4] 呂信萍, 吳靜, 陳京濤. 單個B細胞抗體制備技術及其在肝臟疾病中的應用[J]. 臨床肝膽病雜志, 2015, 31(12):2104-2109.

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[6] Bosio A., Huppert V., Donath S., et al. Isolation and Enrichment of Stem Cells. Engineering of Stem Cells, [J]. advances in biochemical engineering/biotechnology, 2009, 114(114):23.

[7] Love J.C., Ronan J.L., Grotenbreg G.M., et al. A microengraving method for rapid selection of single cells producing antigen-specific antibodies[J]. Nature Biotechnology, 2006, 24(6):703-707.

[8] Jin A., Ozawa T., Tajiri K., et al. A rapid and efficient single-cell manipulation method for screening antigen-specific antibody–secreting cells from human peripheral blood[J]. Nature Medicine, 2009, 15(9):1088-1092.

[9] Fitzgerald V., Leonard P., et al. Single cell screening approaches for antibody discovery[J]. Methods, 2016(1-9).

[10] 遲象陽, 于常明，陳薇. 單個B細胞抗體制備技術及應用[J]. 生物工程學報, 2012, 28(6):651-660.

[11] http://commercial.dxy.cn/article/680978?trace=hot
 

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