近年來，病毒載體介導的基因治療領域迅速發展，包括體內外直接療法和基于細胞的方法。然而，基因治療在商業成功之路上也面臨諸多挑戰。本文將探討基因治療藥物商業化進程需要戰略和技術制造創新支持的三個非常重要的領域。如果我們要克服當前供需失衡，有效地發揮基因治療的巨大潛力，在這些關鍵領域的成功將是至關重要的。
 
DOI: 10.18609/cgti.2020.011
引用：細胞和基因治療洞察力2020；6（2），85–92
 
 
基因治療的現狀與展望
 
病毒載體驅動的基因治療領域，結合體內和體外細胞為基礎的治療方法，近年來取得了巨大的增長。第一個獲得全球市場認可的突破性CAR-T細胞療法（諾華公司的Kymriah®和KITE制藥公司的Yescarta®）為過去24個月基因治療的進一步發展鋪平了道路，包括第一個獲得美國FDA批準的以AAV為載體的體內基因治療藥物，Luxturna®（SparkThera­peutics ）。
 
在適應癥方面，腫瘤仍然占主導地位，約占所有細胞和基因治療產品的62%。然而，孤兒單基因疾病治療也在體內基因治療中得到了很好的表現，并且，也有越來越多的適應癥在患者群體更龐大的心血管和傳染病等關鍵治療領域。
 
基因治療臨床管線的發展與基因治療公司的估值上升步伐一致。從吉列德公司以119億美元收購Kite制藥公司到現在，已經過去了2年，這種趨勢持續不減。
 
當然，基因治療朝著商業成功方向的速度發展面臨著挑戰，尤其是在病毒載體制造領域。
 
任何生物產品的生產，無論是單克隆抗體還是基因治療藥物，都有一些重要的考慮因素：原料，設備和耗材是否符合GMP生產是至關重要的；設備和每個工藝步驟的可擴展性同樣重要；穩健性和重現性是商業上可行的生物工藝的先決條件。
 
然而，基因治療總體的更新速度，加上許多候選產品目前正在加速進程的事實意味著生物過程/CMC發展窗口正在有效地縮小。除了這種加速需求之外，基因治療開發商和制造商必須面對的現實是基因療法生物工藝在很大程度上仍來自學術界，呈現上游和下游的質量問題，重現性和可擴展性問題。不僅如此，目前許多的制造設備是來自單克隆抗體領域，雖然這些設備的有效更新正在進行，并且針對基因治療生產的特定需求正在出現新的解決方案，這仍然是一項并未完成的工作。
 
最后，基因治療藥物的生產是一個高度復雜的領域。有不同的載體類型，這些載體的多個血清型（特別是AAV）都可用于基因治療藥物的制造。此外，病毒載體的生產目前涉及多個細胞系的使用。這種標準化的缺乏與成熟的單克隆抗體生產形成了鮮明對比，其僅圍繞CHO細胞和一個相對明確的、基于生物反應器的上游和下游工藝配合。
 
 
本系列將探討3個需要生產策略和生產工藝創新以支持基因治療藥物商業化的重要領域：
 
·可擴展性和再現性
·測試與質量
·生產場地的法規要求
 
如果我們要克服目前的供需失衡，有效地發揮基因治療的巨大潛力，這三方面的成功將是至關重要的。
 
 
一、可擴展性和再現性
 
我們可以將基于哺乳動物細胞培養的病毒載體生產過程分為三個主要階段：上游生產、中游處理和下游純化。上游生產通常從細胞種子復蘇和擴增步驟開始，使用貼壁或懸浮培養。接下來是生產階段，以感染細胞或轉染細胞的方式產生病毒載體。
 
中游處理其開始于病毒載體收獲步驟。可能需要進行裂解以從細胞中提取病毒載體，或者病毒載體已經釋放到培養基中。另外，也可以是兩種方式的結合——這取決于所生產的病毒和特定的工藝。
 
而在澄清操作去除細胞碎片前使用Benzonase®可以最大程度減少宿主蛋白。同樣，根據工藝和生產規模，可能有必要在這一環節進行濃縮步驟，以及通過適當的緩沖液進行換液。下一步是下游純化，其主要目的是去除污染物并獲得高純度產品，以在終端制劑、過濾和灌裝完成之前對產品進行濃縮。
 
當然，有必要對整個過程進行測試，包括為此所需提供的樣品量。在上游生產過程中，起始體積足夠大，意味著可以滿足檢測所需，但是隨著生產流程的進行，體積變小，產品變得越來越珍貴——設計一個取樣和檢測計劃是很重要的。
 
這類流程通常在小規模下運行良好，但隨著需求的增加，生產更多檢測樣品的需求也隨之增加。一種方法是線性擴展（Scale out）：多次進行相同定義的單元操作。這是一個好主意，因為它是已知的單元操作工作。以貼壁細胞擴增為例，可以從T型瓶開始，然后進入一個稍大的容器，比如分層T型瓶。同樣的概念也適用于懸浮細胞，從最初的搖瓶或轉瓶，擴大到多個轉瓶。然而，這種方法有一定的局限性，主要瓶頸是所需的空間和操作數量，潔凈室空間與培養箱數量有限，所需的勞動量也是進一步的限制因素。因此，上述方法只適用于中小型生產。
 
有必要考慮一種不同的方法，即比例擴展(Scale up)。比例擴展與線性擴展概念相同，即更大的表面積，但是需要更多地關注單元操作和流程本身。例如，對于貼壁細胞的放大，同樣的原理：從T型瓶開始，然后轉移到10層T型堆，以及可以再次到更大表面積的36層超堆棧，然后重復多個這樣的操作單元。對于懸浮細胞，可以使用搖瓶，然后轉入小型生物反應器（例如搖床或小型一次性生物反應器），最后過渡到中型攪拌生物反應器。這是一種稍微改進的方法，最終仍然會遇到同樣的瓶頸，即沒有足夠的空間來進行所有的單元操作。因此，比例拓展是一種可行的方法，但只適用于中期規模到或許大規模生產初期。
 

 
新技術的出現有可能實現真正的大規模生產。這些技術涉及規模化的方法，但超越了傳統的概念。例如，在過去，10層超堆棧可能被限制在每批約20或30個單元，而現在可以進入固定床生物反應器，占地面積小，但表面積可達500μm。類似地在懸浮細胞培養方面，最近生物反應器的創新也取得了巨大的進步。現在的生物反應器有各種各樣的尺寸，從50升到2000升，具有與潔凈室空間兼容的規格。雖然大型生物反應器在單克隆抗體領域中被長期使用，但是，對病毒載體的需求第一次達到了這樣的水平，即大型生物反應器必然成為基因治療的所需。
 
綜上所述，近幾年上游生產力有了很大的進步，現在越來越多的挑戰來自于優化中間處理步驟和下游工藝開發：
 
·關于中間處理步驟，人們必須認識到包含了大量病毒載體的料液特點，例如發酵過程中所產生的污染物，相應地擴大澄清步驟；深入了解使用的流速、壓力和剪切力；可能需要多個澄清濾器和多種類型的澄清濾器。這些規模相關的因素都需要由工藝開發小組來考慮。
 
·同樣的考量也適用于下游純化。在小試時，低污染負荷意味著只需要一個相對簡單的純化方案。然而重要的是要記住，濃度更高的產品伴隨著更多的污染物，體積是下游處理的關鍵。還必須考慮生產過程中使用的培養基類型——所選擇培養基的蛋白質組成在病毒產物與基質的結合中起關鍵作用。
 
病毒載體的大小和性質，以及壓力和剪切力等因素必須在層析優化和/或純化方案中被考慮。因為層析具有穩健性和可擴展性的特點，所以通常被推薦作為純化的一種手段。在這個階段有許多變量和選擇：對于最終產品的使用要求決定了純化所需的步驟；結合/洗脫可以聚焦在產品本身上，或者采用流穿模式對污染物進行分離，這些是影響過程穩健性的關鍵開發決策。一旦獲得最終產品，要了解該產品的性質，以避免在最終過濾步驟中的大量損失（根據需要和工序，這可能緊接著最終制劑步驟）。
 
近年來病毒載體需求量迅速增加，為了達到更穩健、可擴展的過程，需要明確優化步驟。此外，在探索提高生產率的方法時，需要跳出思維定勢。例如，固定床生物反應器有助于擴大貼壁培養，無需進行懸浮馴化，而這些工作是具有挑戰性的，或者也可以考慮微載體懸浮技術。
 
 
 
總而言之，盡管病毒載體上游生產迄今為止可能集中了大多數焦點和創新，但是不要忘記中游和下游過程——以確保整體是可擴展的，而不僅僅是一個或兩個組成部分。
 
值得注意的是，生產更大量的病毒載體并不是滿足日益增長需求的唯一答案。基因傳遞和靶向的進一步創新和改進將導致未來需要的病毒載體數量減少，比如，轉導效率的增加和/或傳遞系統的優化。最后，一些公司正在致力于改進培養基、緩沖液和其他組分，以便更好地維持細胞生長和病毒生產。