長期以來，微生物組通過其在免疫力和抵抗病原體感染等方面的作用，被認為是決定老年人健康狀況的關鍵因素。老年人體內的微生物群落通常表現出個體差異的增加和多樣性的減少，因此與免疫衰老、慢性全身炎癥和虛弱有關。而百歲老人（100 歲及以上）卻不太容易患上與年齡相關的慢性病，推測百歲老人腸道微生物群中存在特有的成員，能促進對病原體感染和其他環境壓力的抵抗力。日本慶應義塾大學Yuko Sato團隊展示了百歲老人獨特的腸道微生物群，富含能夠產生獨特的次級膽汁酸 (如Isoallo-LCA) 的微生物，這些次級膽汁酸代謝能夠抑制革蘭氏陽性菌的生長，對腸道菌群結構造成直接影響。相關成果發表于《Nature》。
 

百歲老人的腸道菌群特征

招募一個由三個年齡段組組成的隊列：百歲老人（平均107歲，n = 160）、老年人（85-89 歲，n=112）和年輕人（21-55歲，n=47）。臨床數據表明大多數百歲老人沒有肥胖、糖尿病、高血壓和癌癥等慢性病，與老年人組相比，這些疾病的患病率無顯著增加。收集三組糞便樣本并表征其微生物組（不包括3名百歲老人和1名接受抗生素治療的老年人）。主坐標軸分析（PCoA）顯示百歲老人和兩個對照組之間的菌群組成存在顯著差異。其中一些類群在百歲老人組和對照組中顯示出不同的豐度。Alistipes、Parabacteroides、Bacteroides、Clostridium和 Methanobrevibacter在百歲老人中顯著富集，其中Clostridium scindens具有7α-脫羥基功能，可以將初級BAs轉化為次級BAs。
 

百歲老人獨特的膽汁酸特征

宏基因組分析結果顯示，百歲老人組中，誘導膽汁酸（bai）操縱子基因的相對豐度增加，隨后對糞便膽汁酸的分析結果顯示，各組的總膽汁酸負荷無顯著差異，但百歲老人表現出其獨特的分布，包括初級BAs水平較低，鵝去氧膽酸 (CDCA) 代謝物水平升高，且異石膽酸（isoLCA）、3-oxoLCA、alloLCA、3-oxoalloLCA和isoalloLCA的水平在百歲老人組中顯著升高，而在老年人組和年輕對照組中則相對較低。此外，糞便pH值與這些BAs的濃度呈正相關，腸道環境可能會促進某些菌群的繁殖和/或參與這些BA合成酶的表達和活性。
 

圖1. 百歲老人的糞便 isoLCA、3-oxoLCA、alloLCA、3-oxoalloLCA 和 isoalloLCA 顯著升高
 

產生isoLCA-、3-oxoLCA-、3-oxoalloLCA-和isoalloLCA-細菌菌株的鑒定

有研究指出E.lenta和Ruminococcus gnavus可通過3α-羥基類固醇脫氫酶(3αHSDH)和3βHSDH分別催化DCA和3-oxoDCA生成3-oxoDCA和isoDCA 。因此，推測3-oxoLCA和isoLCA以類似的方式通過5BR、3αHSDH和3βHSDH的作用產生。另外，3-oxoallo-、allo- 和isoallo-LCA生成的合成途徑此前尚未確定。推測3-oxoalloLCA可能是由3-oxo-Δ4-LCA通過5α-還原酶(5AR)同源物生成的。而3-oxoalloLCA轉化為alloLCA或isoalloLCA可能分別使用3αHSDH或3βHSDH，這與之前描述的3-oxoDCA轉化為DCA或isoDCA的過程相一致。
 

隨后對一名富含這些次級膽汁酸的百歲老人（CE91，超過110歲）糞便樣本進行培養，并分離出68株獨特的菌株，這些菌株概括了CE91的菌群結構。然后，分別用CDCA、LCA 或3-oxo-Δ4-LCA作為起始底物培養單個分離物。結果顯示，與CDCA共培養不會導致任何培養物中產生目標BAs，而與LCA或3-oxo-Δ4-LCA共培養后，在68株菌株中分別有12株具有產生3-oxoLCA的能力和8株具有產生isoLCA的能力，表明這些菌株具有3αHSDH、3βHSDH和/或5BR活性。而且，與3-oxo-Δ4-LCA共培養后，在Parabacteroides merdae St3、Odoribacter Laneus St19、Odoribacteraceae spp.St21-24以及較低程度的Bacteroides dorei St6-7的培養物中觀察到isoalloLCA的顯著積累，表明這些菌株同時具有5AR 和3βHSDH酶活性。此外，P. goldsteinii St1-2、Bacteroides thetaiotaomicron St9、B.uniformis St10-13、Alistipes finegoldii St15-16、A. onderdonkii St17-18和O. Laneus St20 培養物都顯示出3-oxoalloLCA的顯著富集，但isoalloLCA的水平卻很低或沒有，可能是由于在這些培養條件下攜帶5AR但3βHSDH的活性缺乏或不足。共發現20個擬桿菌屬菌株能夠將 3-oxo-Δ4-LCA轉化為3-oxoalloLCA，其中8個能夠產生isoalloLCA。AlloLCA始終低于檢測限，表明攜帶5AR的分離株在測試培養條件下 3αHSDH的活性缺乏或不足。
 

5AR-和3βHSDH介導3-oxo-Δ4-LCA向isoalloLCA的轉化

對68個分離株進行基因組測序分析，鑒定到21個擬桿菌屬中存在與人5AR (SRD5A1) 直系同源的序列，氨基酸序列相似性＞30% 。在21個菌株中，發現與膽汁酸代謝功能相關的基因簇，包括注釋為NADH：黃素氧化還原酶的序列，預測為5BR。還鑒定到注釋為短鏈脫氫酶 (SDR)的序列，預測其為3βHSDH。其中3βHSDH序列包括兩組：I組序列 (3βHSDH-I)與P. merdae St3 3βHSDH顯示出高度相似性 (>40%)，而II組序列 (3βHSDH-II) 彼此密切相關但與P.merdae 3βHSDH沒有相關性。推測5AR和3βHSDH基因簇的攜帶與體外3-oxo-Δ4-LCA的 3-oxoalloLCA和isoalloLCA 產生明顯相關。基因組序列還揭示了P. distasonis、Raoultibacter和Eggerthella菌株攜帶3αHSDH基因。表明上述鑒定的擬桿菌目基因簇可以協同產生isoalloLCA和相關BAs。
 

構建缺乏編碼5AR、3βHSDH或5BR的基因的P. merdae St3突變體，正如預期的那樣，當與3-oxo-Δ4-LCA一起培養時，P. merdaeΔ5AR無法產生3-oxoalloLCA或 isoalloLCA，而P. merdaeΔ3βHSDH能夠產生3-oxoalloLCA但不能產生isoalloLCA。同樣地，當與3-oxoalloLCA一起培養時，P. merdaeΔ5AR以類似于野生型菌株的方式產生isoalloLCA，而 P. merdaeΔ3βHSDH 則不能產生。P. merdaeΔ3βHSDH也不能將3-oxoLCA轉化為 isoLCA，證實3βHSDH可以利用反式和順式BAs作為底物。P. merdaeΔ5BR從3-oxo-Δ4-LCA 或 3-oxoalloLCA產生isoalloLCA，但在將3-oxoLCA 轉化為3-oxo-Δ4-LCA時表現出缺陷。這些結果證實了5AR、3βHSDH和5BR參與了人類腸道菌群產生3-oxoLCA、isoLCA、3-oxoalloLCA和isoalloLCA。
 

那么這些分離株是否可以在體內產生大量的isoalloLCA？把選定12種的擬桿菌屬分離株分別定殖于無菌 C57BL/6 (B6) 小鼠體內，并喂食含3-oxo-Δ4-LCA的飲食。糞便膽汁酸分析結果顯示只有Odoribacteraceae菌株能誘導isoalloLCA的大量積累。盡管P. merdae St3在體外可以將3-oxo-Δ4-LCA轉化為isoalloLCA，但在體內僅檢測到較低水平的isoalloLCA。用P. merdae St3而非P. merdaeΔ5AR定殖的小鼠糞便中表現出顯著的3-oxoalloLCA積累，表明P. merdae 5AR在體內活性較弱。B.uniformis、B.thetaiotaomicron 和B.dorei 能夠產生3-oxoalloLCA，但不能有效地將其轉化為isoalloLCA。總之，體內數據表明共生5AR和3βHSDH的活性依賴于環境，并且腸道環境（至少在小鼠中）有利于 Odoribacteraceae產生isoalloLCA。
 

圖2. 鑒定參與isoalloLCA和相關BAs產生的細菌菌株和基因
 

IsoalloLCA對革蘭氏陽性病原體的抗菌作用

已知次級BAs可以調節宿主代謝和免疫反應（包括調節T細胞）和防止腸道病原體擴增。用百歲老人體內顯著富集的次級BAs分別與不同類型革蘭氏陽性和陰性病原體共培養，結果顯示isoalloLCA可顯著抑制所有測試革蘭氏陽性病原體的生長，在WCA培養基中抑制90%生長所需的最小抑制濃度(MIC90)值范圍為0.5-3μM，在BHI培養基中為3-6.25μM。相比之下，所有革蘭氏陰性病原體都對isoalloLCA具有抗性。電子顯微鏡分析顯示isoalloLCA具有殺菌作用，誘導了C. difficile和VRE的形態學改變，包括塌陷、腫脹和多重橫壁。這些結果表明，isoalloLCA對革蘭氏陽性病原體具有強烈的殺菌/抑菌作用。
 

將來自艱難梭菌感染（CDI）患者的糞菌移植到無菌B6小鼠，并喂食含0.1% isoalloLCA的飲食。結果顯示isoalloLCA給藥顯著減少了C. difficile的脫落。隨后使用Cyp2c70-/- cyp2a12-/-雙敲除(Cyp DKO)小鼠，該小鼠模擬了具有高水平LCA衍生物和缺乏鼠膽酸(MCA)的人類膽汁酸譜。用C. difficile 630感染SPF Cyp DKO小鼠后用Odoribacteraceae St21反復灌胃。Odoribacteraceae給藥顯著增加糞便isoalloLCA水平并顯著抑制了艱難梭菌脫落，使其低于檢測下限。相比之下，盡管Odoribacteraceae植入程度相似，但接受相同處理的野生型小鼠未能產生isoalloLCA并抑制艱難梭菌脫落。這些結果表明 Odoribacteraceae及其衍生物BAs（包括 isoalloLCA），有助于抑制革蘭氏陽性病原體在體內的擴增。
 

圖3. IsoalloLCA對革蘭氏陽性病原體具有強大的抗菌活性
 

isoalloLCA對共生腸道菌群的影響

隨后將Bas與培養健康志愿者糞便共培養。與IsoalloLCA孵育后，革蘭氏陽性菌(如Faecalibacterium、 Bifidobacterium、Streptococcus)顯著減少，而革蘭氏陰性菌(如Bacteroides、Alistipes)相應增加。與百歲老人腸道菌群中Bacteroides和Alistipes的富集和Streptococcus的消失相一致，這表明IsoalloLCA可直接影響腸道菌群結構并保護腸道免受潛在病原體侵害。
 

腸道菌群結構與膽汁酸譜的關聯

對參與者宏基因組數據進一步分析發現，在35個物種（所有Bacteroidales）中鑒定出5AR和3βHSDH基因簇。這些基因簇可分為三組：V1、V2和V3。V1簇包含5AR以及3βHSDH-I 和3βHSDH-II，存在于Odoribacter的基因組中，V3簇包含5AR和3βHSDH-II，存在于Alistipes的基因組中。而V2簇包含5AR和3βHSDH-1，并由不同的Bacteroidales物種攜帶。同時V1和V3簇與隊列中糞便isoalloLCA、3-oxoalloLCA、alloLCA、3-oxoLCA 和 isoLCA 的水平呈正相關。并且攜帶V1或V3的Odoribacter和Alistipes物種在百歲老人中比其他群體更豐富。而V2簇的豐度與這些BAs的濃度呈負相關，這表明5AR與3βHSDH-II(而非3βHSDH-I)一起攜帶是產生isoalloLCA和相關BAs所必需的。
 

隨后將菌群分為三種類型（稱為群落類型1、2 和 3）。結果顯示年輕群體的群落結構主要是2型，而百歲老人主要是3型，其次是1型。重要的是，群落類型1和3的個體，相對于攜帶V2的個體，攜帶V1和V3物種的菌群豐度更高。此外，在群落類型1和3的個體中觀察到更高水平的3-oxoLCA、isoLCA、alloLCA、3-oxoalloLCA和isoalloLCA，而這一趨勢在CDCA中則相反。這些結果進一步驗證腸道菌群結構影響腸道BAs，并且群落類型1和3與日本百歲老人有關，并可能產生有助于isoalloLCA物種擴展和發揮功能的環境。
 

圖4. 腸道微生物組結構與膽汁酸譜的關聯
 

小結

本研究通過鑒定百歲老人特有的腸道菌群特征，確定了促進 isoLCA、3-oxoLCA、3-oxoalloLCA 和 isoalloLCA 產生的微生物種類和基因/途徑。同時還闡述了Isoallo-LCA對革蘭氏陽性（不是革蘭氏陰性）多重耐藥病原體（包括Clostridioides difcile和Enterococcus faecium）強大的抗菌作用。這些發現揭示，特定的膽汁酸代謝可能參與降低病原體感染的風險，從而可能有助于維持腸道穩態。
 

參考文獻

Yuko Sato, et al. Novel bile acid biosynthetic pathways are enriched in the microbiome of centenarians. Nature. 2021.
 

原文閱讀，請長按識別下方二維碼

繪譜幫你測

本研究利用膽汁酸檢測及宏基因組技術揭示百歲老人體內特有的生物合成途徑。麥特繪譜擁有成熟的代謝物定性和定量平臺，本研究涉及的膽汁酸檢測及宏基因等技術，麥特繪譜均可提供全套解決方案，詳情歡迎咨詢麥特繪譜。