核酸檢測實驗室自動化的最新發展和趨勢
名詞縮寫釋義
1、Whole process automation nucleic detection system
（WAS)全過程自動化核酸檢測系統
2、Integrated nucleic acid detection machine
(IDM)集成核酸檢測機
(POCT)護理點檢測
4、High-efficiency particulate air filter
(HEPA)高效微粒空氣過濾器
核酸檢測主要包括三個步驟：
1）核酸提取，
2）擴增系統制備，
3）聚合酶鏈反應（PCR）擴增。
它主要在分子實驗室的三到四個獨立的封閉區域內完成。為了避免污染，科學家們穿過一條特殊的走廊，通過封閉區域之間指定的轉移窗口轉移材料。然而，隨著核酸檢測技術的不斷進步，一種操作簡單、耗時少、成本低的新型核酸檢測系統有望問世。這種系統可以應用于護理點檢測（POCT），無需專業操作員和精密輔助設備，甚至可以用于戶外社區診所。因此，整合核酸提取、擴增和檢測的 POCT 核酸分析系統的研究已在世界范圍內展開。越來越多來自各個領域的研究人員致力于這項研究，并致力于解決核酸檢測應用中的許多問題。
隨著 COVID-19 在世界各地的爆發，核酸檢測需求的突發性增長給各個國家和機構帶來了巨大壓力。實驗室檢查員每天必須完成數千到數萬次核酸檢測。這種高強度的工作和巨大的感染風險將導致新的問題和隱患。因此，各個公司和科研機構都開發了核酸檢測的全過程自動化系統。同時，為了滿足現場快速檢測的需要，還開發了集成快速檢測儀器。
（1）全過程自動化核酸檢測系統（WAS）
WAS 包括核酸提取、擴增系統制備和核酸擴增分析模塊。每個模塊相對獨立，通過機械自動化和集成，所有模塊都由自動化中心控制，以利用自動化甚至無人系統。WAS 具有以下優點：自動化程度高；生物安全風險低；高通量系統。高通量是這個系統最顯著的特點。
（2）集成核酸檢測機（IDM ）
WAS 涉及的檢測流程環節多，要求一定的空間，影響了其在護理點檢測（POCT）中的應用。IDM 體積小，自動化程度高，生物安全風險低。該集成機器還可以完成核酸檢測的所有程序。然而，與 WAS相比，IDM 是一個獨立的設備，IDM 中的每個模塊不是獨立的，而是集成到系統中。這兩種檢測系統功能相似，但適用于不同的場景。WAS 由三個或更多模塊組成，該系統通常用于大型醫院和機構中的大量樣本的快速檢測和篩查。由于占用空間大，該設備經常安裝在獨立的房間或空間中。IDM 是一種獨立的設備，主要用于社區檢測機構、現場檢測和 POCT。
02 核酸檢測系統的原理及發展現狀
核酸檢測自動化系統的組成和原理如圖（Fig.1）所示。根據工作流程，系統可分為四個獨立工作的模塊：自動分配（分杯）、自動核酸提取、自動擴增系統制備和自動擴增分析模塊。各模塊之間的物料通過搬運裝置（機械手或專用輸送機）進行輸送，各模塊由主控終端通過通信總線進行協調。為了防止污染和生物安全風險，每個模塊或系統獨立采用高效微粒空氣過濾器（HEPA）來保持負壓。核酸提取過程旨在從樣本中分離和純化核酸，包括 DNA 和 RNA，以滿足擴增要求。PCR或其他技術用于執行特定的核酸擴增步驟，并通過測量熒光信號或其他信息來檢測結果。
隨著分子生物學技術的發展，檢測方法越來越多。然而，大多數核酸檢測的目標是從生物樣本中獲得高度純化的核酸模板。核酸模板的質量對檢測靈敏度和特異性有重要影響。因此，核酸提取方法是核酸檢測過程中的關鍵部分。世界各地的研究人員投入了核酸提取的研究和方法開發，并長期探索提取試劑和材料的應用。人們發明了一系列經典的核酸提取方法，如苯酚/氯仿提取法、硅膠基質法、磁珠法和陰離子交換法。隨著微加工技術的進步，磁珠提取方法得到了廣泛的認可。大多數核酸檢測儀器都采用了磁珠提取系統。
核酸擴增是核酸檢測中最常用的方法，而 PCR 是 DNA 或 RNA 擴增中應用最廣泛的技術。PCR 是一種體外酶法合成特定片段的方法。它由幾個連續反應組成，包括高溫變性、低溫退火（復性）和適當的溫度延伸。擴增產物可以是一種新的模板，允許快速擴增目標 DNA。該方法特異性強、靈敏度高、操作簡單、省時。大多數自動化儀器中的擴增方法是實時 PCR。近年來，大量放大步驟和探針的使用使得能夠同時檢測多個目標。此外，等溫擴增引起了越來越多的關注。與其他方法相比，該方法成本更低、耗時更少，同時需要更簡單的設備和更方便的操作。
↑↑圖片為曼森生物自主研發核酸檢測自動化掃描機器人
03.主流產品
Mainstream products
大多數自動化儀器由四個模塊組成：樣品引入、樣品轉移、樣品純化和放大檢測。從樣品轉移、樣品制備、放大檢測、結果計算到數據上傳的整個過程都可以自動化。大多數儀器中唯一的手動操作步驟是將試劑耗材和樣品管放入自動儀器中。這些系統是完全自動化的測試平臺，真正實現了“樣本輸入和結果輸出”，可以應用于具有不同測試通量（低、中或高）的實驗室的需要。用戶定義的工作流程和全面的檢測菜單可以同時進行多種病原體的檢測。
這些儀器的操作步驟、核酸提取、擴增系統制備和 PCR 擴增幾乎相同。磁性玻璃珠可以結合帶負電荷的核酸，適合在自動化儀器中提取核酸。自動化步驟的目的是移動試劑管和轉移液體，不同儀器的操作順序略有不同。雖然在一些系統中已經應用了幾種等溫擴增方法，但 PCR 擴增仍然是檢測的首選方法。在這些儀器中，Cobas 8800 具有最大的樣品裝載能力。大樣本裝載能力允許人員離開機器 8 小時或更長時間，這為該系統提供了過載樣本篩選的明顯優勢。Panther Fusion Assays 和 ANAS9850 可以在 8 小時內完成 500–600 個樣本的檢測。
GeneXpert Infinity-80 系統（Fig 2c）是最著名的 POCT 產品。POCT 產品的特點是“樣品輸入，結果輸出”。該儀器由一個特殊的微流控試劑盒和一個積木反應模塊組成。樣品制備、核酸提取純化、擴增試劑制備、擴增檢測均在專用試劑盒中完成。獨立的反應單元可以在不受批次限制的情況下進行及時檢測。
Cobas 6800/8800（羅氏）（Fig 2a）、NeuMoDxTM 288（Qiagen）（Fig 2b）、Panther Fusion Assays（Hologic）（Fig 2d）、ANAS9850（AmpllyBiotech，中國）（Fig 2e）、AutoMolec 3000/1600（Autobio Diagnostics，中國）、AutraMic mini（Liferiver，中國）（Fig 2g）、AutoSAT（Rendu，中國）（Fig 2h），和高保護水平核酸自動檢測系統（Cohere，中國）（Fig 2i）。
盡管檢測能力低于其他系統，但在特定條件下仍有廣泛的應用前景，例如初級診所和其他沒有分子生物學實驗室的醫院。Panther Fusion system 增加了在單一全自動平臺上運行實時 PCR、轉錄介導擴增（TMA）和 RT-TMA 分析的能力。此外，患者樣本到達實驗室后，可以立即加載到 Panther 系統進行測試，這可以提高效率和工作流程。
ANAS985 于 2015 年獲得 CFDA 批準。它是中國最早的集成核酸檢測機。從樣本輸入到 PCR 定量報告的整個過程是自動化的，3 小時內可以檢測到 96 個樣本。Rendu 的 AutoSAT 符合儀器的原始管裝載要求。與其他系統不同，該系統的擴增方法是等溫擴增。這臺機器可以在 24 小時內完成 500-700 次檢測。高保護水平核酸自動檢測系統由上海 Cohere 電子技術公司和上海科技大學共同開發。結合機械自動處理系統，構建了一套 P2+生物防護等級的全自動核酸檢測平臺系統。該檢測系統是專門為 COVID-19 開發的，該平臺還可以用于高通量無人檢測其他病原體，從而有效降低操作員之間的感染風險。該系統可以滿足不同應用場景和檢測量的需要。每種產品的性能參數比較如下（表 1）。
04.核酸自動檢測系統展望
Prospect of automatic nucleic acid detection system
自動檢測系統正朝著更好的特異性、更高的靈敏度、更快的檢測速度和更低的價格發展。滿足不同應用場景的需求將是未來產品開發的重點。目前，在自動檢測系統中，樣本核酸提取步驟花費的時間最多。因此，通過優化提取方法和自動化設備，核酸提取可以節省時間。同時，可以在系統中使用更合適的生物安全保護策略，以防止樣本之間的交叉污染，降低生物安全風險。通過改進和優化核酸擴增技術，可以提高擴增反應的特異性和敏感性。新興病原體檢測和新亞型檢測的發展對于滿足不同機構的需求也很重要。結合 CRISPR 技術、第三代測序、生物傳感器、納米技術、微流體技術和其他分析技術，將實現對不同檢測目標的更精確檢測。還需要進一步提高儀器的自動化效率。通過結合新的信息處理、傳輸技術和人工智能技術，這些儀器將更加方便使用。隨著當前大流行的全球傳播，對實時診斷技術的需求正在增加。準確、快速、易用、易于推廣的實時疾病診斷技術將成為研究人員關注的焦點。許多國家投入巨資研發新的體外診斷產品，并為預防和控制新出現的傳染病建立了一個可持續的平臺，以應對未來更嚴峻的挑戰。
信息來源：：X. Yuan, G. Sui, D. Zhang et al. Recent developments and trends of automatic nucleic acid detection systems.Journal of Biosafety and Biosecurity,Journal of Biosafety and Biosecurity 4 (2022) 54–58
文獻來源 | 本文由中科院上海生命科學信息中心與上海曼森生物合作供稿
內容審核 | 曼森生物郝玉有博士
排版編輯 | 曼森生物劉娟娟編輯
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