對小鼠肺組織進行高對比度快速成像，可以對肺血管系統的內皮網絡和支持細胞進行可視化研究。

本文介紹了在小鼠肺標本中如何利用THUNDER Imager 3D Cell Culture熒光顯微鏡和即時光學解析（ICC）技術有效地研究控制肺血管形成和維持的細胞和分子機制，以及當肺血管疾病發生時出現的相應問題。肺血管系統是由內皮細胞組成的分支管狀網絡，這些內皮細胞排列在血管上，和支持細胞構成了血管壁。

從健康角度來看，識別在肺動脈、靜脈和毛細血管發育過程中形成肺血管的細胞群類型是很有趣的，有助于它們的維持和修復，以及研究這些細胞的行為和調控信號。

小鼠肺組織圖像：（左）原始寬場圖像和（右）使用Instant Computational Clearing（ICC）技術后的THUNDER高清圖像。圖片來源：美國加利福尼亞州Ross Metzger博士。
 

   簡  介   

肺血管疾病的研究涉及多種方法來探索影響疾病的細胞和分子程序^[1，2]。肺血管從胚胎期開始發育，并在出生后繼續。肺的支管網絡由內皮細胞和支持細胞組成。為了更好地了解血管疾病，科學家研究了形成肺血管的細胞，以及那些有助于血管修復的細胞^[1，2]。

由于管狀結構，以及肺標本很容易有數百微米厚，因此可視化內皮細胞和支持細胞網絡的發育以及血管系統的維持極具挑戰。此處的報告結果展示了如何使用THUNDER Imager 3D Cell Culture顯微鏡，在小鼠肺組織中有效研究肺血管疾病的機制^[3，4]。

   挑 戰   

在肺組織成像時想要獲得真實結果，擁有一種可以快速獲取高對比度三維圖像的解決方案非常關鍵，確保其中的重要細節得到清晰呈現。傳統的寬場顯微鏡能夠對這些厚標本的大面積成像，這種顯微鏡速度快，檢測靈敏度高，但由于非焦信號的干擾，圖像模糊，對比度顯著降低^[3，4]。

   方 法   

使用THUNDER Imager 3D Cell Culture顯微鏡對小鼠肺部標本進行成像。使用FITC、Cy3以及Alexa 633對標本進行免疫染色。為了可視化整個肺組織標本，使用20x Plan Fluo Apo 0.4 NA（數值孔徑）物鏡以及三個熒光通道。為覆蓋280µm厚度的樣品，采集的圖像顯示為由115層光學切片組成的擴展景深（EDoF）投影。

   結 果   

THUNDER Imager 3D Cell Culture可以快速獲取肺組織的三維圖像，然后通過Instant Computational Clearing（ICC）技術去除寬場圖像中會降低對比度的模糊信號（參見圖1）^[3，4]。ICC可以呈現肺組織圖像中的精細結構和細胞水平分辨率，以研究影響肺血管疾病的發育、維持和修復活動^[1，2]。

整個組織圖像采集時間約1min（參見圖1）。

圖1：小鼠肺組織標本的擴展景深（EDoF）投影：A) 原始寬場圖像，B) Instant Computational Clearing（ICC）后的高清圖像。
圖片來源：美國加利福尼亞州Ross Metzger博士。
 

結論

使用THUNDER Imager顯微鏡的Instant Computational Clearing（ICC）技術^[3，4]可以對小鼠肺血管疾病相關的細胞機制進行有效研究。因為與傳統的寬場成像相比，該技術顯著提高了圖像對比度。

References：

1.L.C. Steffes, A.A. Froistad, A. Andruska, M. Boehm, M. McGlynn, F. Zhang, W. Zhang, D. Hou, X. Tian, L. Miquerol, K. Nadeau, R.J. Metzger, E. Spiekerkoetter, M.E. Kumar, A Notch3-Marked Subpopulation of Vascular Smooth Muscle Cells Is the Cell of Origin for Occlusive Pulmonary Vascular Lesions, Circulation (2020) vol. 142, no. 16, pp. 1545–1561, DOI: 10.1161/CIRCULATIONAHA.120.045750.

2.M. Boehm, X. Tian, Y. Mao, K. Ichimura, M.J Dufva, K. Ali, S. Dannewitz Prosseda, Y. Shi, K. Kuramoto, S. Reddy, V.O. Kheyfets, R.J. Metzger, E. Spiekerkoetter, Delineating the molecular and histological events that govern right ventricular recovery using a novel mouse model of pulmonary artery de-banding, Cardiovascular Research (2019) vol. 116, iss. 10, pp. 1700–1709, DOI: 10.1093/cvr/cvz310.

3.J. Schumacher, L. Bertrand, THUNDER Technology Note: THUNDER Imagers: How Do They Really Work? Science Lab (2019) Leica Microsystems. 

4.L. Felts, V. Kohli, J.M. Marr, J. Schumacher, O. Schlicker, An Introduction to Computational Clearing: A New Method to Remove Out-of-Focus Blur, Science Lab (2020) Leica Microsystems.

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