細胞凍存與細胞復蘇，是細胞培養過程中的常見工作。細胞凍存，是指將細胞貯存在超低溫環境中，使細胞暫時“冬眠”的技術，在需要的時候再進行復蘇。細胞凍存是細胞保存的主要方法之一。細胞復蘇，是把凍存在-80℃冰箱或液氮中的細胞快速解凍重新培養，細胞恢復生長的過程。那么為什么復蘇細胞要慢速冷凍快速復蘇呢?

除了凍存保護劑之外，冷凍和升溫的速度也直接影響細胞的存活率。做過細胞凍存復蘇的人都可能聽說過“慢凍快融”的原則。這樣可以最大限度的保存細胞活力。如今細胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護劑，這兩種物質能提高細胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使細胞內的水分滲出細胞外，減少細胞內冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細胞損傷。復蘇細胞應采用快速融化的方法，這樣可以保證細胞外結晶在很短的時間內即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內形成胞內再結晶對細胞造成損傷。

慢凍是為了減少細胞內的水分，從而降低水分結冰導致的傷害。為了說清這個道理，需要一點點物理學知識。我們知道，水溶液結冰是一個溶質溶劑相互作用的過程。溶液的濃度越高，開始結冰的溫度（冰點）就越低。溶液結冰時，作為溶劑的水優先結冰，同時把溶質外排，這樣就導致溶質的濃度越來越高。溶質的濃度越高，則剩下的溶液要進一步結冰，需要的溫度就更低，直到一個最終完全結冰的溫度（共熔點）。也就是說，水溶液的結冰是一個溫度逐漸降低（從冰點最后降低到共熔點）、溶液濃度逐漸升高的過程。

但是這樣的結冰過程也是有條件的，那就是外界的溫度不能急劇降低，讓溶劑結冰的時候，有足夠的時間把溶質排除到冰體之外。否則，溫度降低太快，溶質就會被困在溶劑中間一同凝固，這在物理學上叫玻璃化凝固，而非真正的結冰。慢凍就是為了讓凍存液真正結冰，結冰的過程中，凍存液的濃度會逐漸提高，滲透壓也逐漸提高，細胞內的水分就會逐漸滲透到細胞外，從而減弱細胞內水分結冰導致的傷害。

理論和實踐表明，細胞冷凍的速度控制在每分鐘降低1°C效果好。

那么快融又是什么道理呢？快融是為了防止融解過程中的局部區域發生反復凍融。

凍存原則

細胞凍存原則為“慢凍”，即讓細胞在緩慢降溫的條件下逐漸冷凍。

如果直接將細胞懸液放在超低溫下快速冷凍，細胞會受到冷凍損傷而死亡。在凍存液中添加的保護劑（如DMSO、甘油）和在凍存盒中添加的異丙醇，都起到程序性降溫的作用。

細胞凍存密度

細胞凍存和復蘇過程中，不可避免會損失部分細胞，所以凍存的密度不能太低。提高凍存密度有助于提升細胞復蘇存活率，推薦密度為100~300萬細胞/mL。

細胞凍存步驟

待細胞生長狀態良好時，可進行細胞凍存。下面 T25 瓶為例

a.收集細胞，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數。

b.根據細胞數量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標識。

c.將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

細胞復蘇講究“快融”，越快融化，細胞所受損傷就越小。細胞復蘇的操作不復雜，但每一步都必須穩扎穩打，才能最大限度地提高復蘇存活率。

細胞復蘇步驟

1.凍存細胞從液氮中取出后,立即放入37°C水浴中，輕輕搖動冷凍管,使其在1分鐘內全部融化（不要超過3分鐘），加4 mL培養基混合均勻。

2.在1000 rpm條件下離心5 min，棄去上清液，加1-2 mL培養基后吹勻

3.將所有細胞懸液加入含適量培養基的培養瓶中培養過夜（或將細胞懸液加入6 cm皿中，加入約4mL培養基，培養過夜）。

4.第二天換液并檢查細胞密度。

如何判斷細胞復蘇成功與否

判斷細胞復蘇成功與否，需要看復蘇后細胞貼壁率及細胞存活率（細胞存活率將凍存管內剩余的細胞，用臺盼藍染色法檢測復蘇細胞的存活率。呈藍色的細胞為死細胞，活細胞不著色。用細胞計數板和計數器計數細胞，得出細胞存活率）。如果復蘇后95%以上的細胞貼壁，而且細胞的活性好，這就說明細胞復蘇的過程沒有問題。復蘇的細胞恢復到正常生長，達到正常的生長特性（比如細胞群體倍增時間等）后要再凍存以補充細胞儲存數量。

需要注意的是，復蘇的細胞需要一段時間恢復狀態，當復蘇后的細胞密度低于80%時，48小時內不要換液，待細胞形態、生長速度等恢復正常，再進行細胞傳代等操作，不要因為復蘇后兩三天細胞狀態不好就丟棄，應耐心等待至少一周。