免疫組化(IHC)實(shí)驗(yàn)操作過程介紹
免疫組化（IHC）實(shí)驗(yàn)，即免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)，是生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中不可或缺的一項(xiàng)技術(shù)。它利用抗原與抗體之間的特異性結(jié)合，通過顯色反應(yīng)來定位和檢測(cè)組織或細(xì)胞中的特定抗原，從而揭示生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的分布和表達(dá)情況。
在實(shí)驗(yàn)過程中，研究人員需要精心挑選適當(dāng)?shù)目贵w，這些抗體能夠特異性地識(shí)別目標(biāo)抗原。隨后，抗體與組織或細(xì)胞樣本進(jìn)行孵育，讓抗體與目標(biāo)抗原充分結(jié)合。接著，通過添加顯色劑，使得結(jié)合了抗體的抗原部位呈現(xiàn)出特定的顏色，從而能夠在顯微鏡下清晰地觀察到抗原的分布和表達(dá)情況。
免疫組化實(shí)驗(yàn)具有高度的特異性和敏感性，能夠檢測(cè)到非常低濃度的抗原。因此，它在疾病診斷、藥物研發(fā)以及生物學(xué)研究中具有廣泛的應(yīng)用。例如，在癌癥研究中，免疫組化實(shí)驗(yàn)可以幫助研究人員了解腫瘤組織中特定蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，從而評(píng)估患者的預(yù)后和制定個(gè)性化的治療方案。此外，免疫組化實(shí)驗(yàn)還可以用于研究生物體內(nèi)各種生理和病理過程。通過檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)或不同條件下的抗原表達(dá)情況，研究人員可以揭示生物體內(nèi)分子水平的動(dòng)態(tài)變化，為深入理解生命活動(dòng)提供有力的工具。
具體實(shí)驗(yàn)過程如下：
1、SP三步法
1）石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水。
2)0.3%或3%H2O2去離子水（無色液體）孵育10-30分鐘，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性。
3）蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘
4）候選步驟：采用抗原修復(fù)：微波（建議30分鐘內(nèi)4次中火）、高壓、酶修復(fù)方法。自然冷卻，再用3分鐘×3次.
5）血清封閉：室溫15-30分鐘，盡可能與二抗來源一致。傾去，勿洗。
6）滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗，37℃孵育2~3小時(shí)或4℃過夜（最/好復(fù)溫）。PBS沖洗，3分鐘×5次。
7）滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫或37℃孵育30分鐘-1h。
8)PBS沖洗，3分鐘×5次。
9）滴加SP（鏈霉親和素-過氧化物酶），室溫或37℃孵育30分鐘-1h。10)PBS沖洗，3分鐘×5次。
11）顯色劑顯色（DAB等）。
12）自來水充分沖洗。
13）可進(jìn)行復(fù)染，脫水，透明。
14）選擇適當(dāng)?shù)姆馄瑒┓馄?br />
2、即用型二步法
1）脫蠟、水化組織切片。
2）根據(jù)所應(yīng)用的一抗的特殊要求，對(duì)組織切片進(jìn)行預(yù)處理。
3) 0.3%或3%H2O2去離子水孵育5分鐘-30分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS或TBS沖洗。
4）滴加一抗，室溫或37℃孵育30~60分鐘，或4℃過夜，PBS或TBS浸洗3分鐘×5次。
5）滴加enhangcer增強(qiáng)劑，37℃30min，PBS或TBS浸洗3分鐘×5次。
6）滴加通用型IgG抗體-Fab段-HRP多聚體，室溫/37℃孵育30分鐘-1h，PBS/TBS沖洗，3分鐘×5次。
7）應(yīng)用DAB溶液顯色。
8）蒸餾水沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片。
總之，免疫組化實(shí)驗(yàn)是一種強(qiáng)大而精確的生物學(xué)研究技術(shù)，它在推動(dòng)醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。
在實(shí)驗(yàn)過程中，研究人員需要精心挑選適當(dāng)?shù)目贵w，這些抗體能夠特異性地識(shí)別目標(biāo)抗原。隨后，抗體與組織或細(xì)胞樣本進(jìn)行孵育，讓抗體與目標(biāo)抗原充分結(jié)合。接著，通過添加顯色劑，使得結(jié)合了抗體的抗原部位呈現(xiàn)出特定的顏色，從而能夠在顯微鏡下清晰地觀察到抗原的分布和表達(dá)情況。
免疫組化實(shí)驗(yàn)具有高度的特異性和敏感性，能夠檢測(cè)到非常低濃度的抗原。因此，它在疾病診斷、藥物研發(fā)以及生物學(xué)研究中具有廣泛的應(yīng)用。例如，在癌癥研究中，免疫組化實(shí)驗(yàn)可以幫助研究人員了解腫瘤組織中特定蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，從而評(píng)估患者的預(yù)后和制定個(gè)性化的治療方案。此外，免疫組化實(shí)驗(yàn)還可以用于研究生物體內(nèi)各種生理和病理過程。通過檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)或不同條件下的抗原表達(dá)情況，研究人員可以揭示生物體內(nèi)分子水平的動(dòng)態(tài)變化，為深入理解生命活動(dòng)提供有力的工具。
具體實(shí)驗(yàn)過程如下：
1、SP三步法
1）石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水。
2)0.3%或3%H2O2去離子水（無色液體）孵育10-30分鐘，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性。
3）蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘
4）候選步驟：采用抗原修復(fù)：微波（建議30分鐘內(nèi)4次中火）、高壓、酶修復(fù)方法。自然冷卻，再用3分鐘×3次.
5）血清封閉：室溫15-30分鐘，盡可能與二抗來源一致。傾去，勿洗。
6）滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗，37℃孵育2~3小時(shí)或4℃過夜（最/好復(fù)溫）。PBS沖洗，3分鐘×5次。
7）滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫或37℃孵育30分鐘-1h。
8)PBS沖洗，3分鐘×5次。
9）滴加SP（鏈霉親和素-過氧化物酶），室溫或37℃孵育30分鐘-1h。10)PBS沖洗，3分鐘×5次。
11）顯色劑顯色（DAB等）。
12）自來水充分沖洗。
13）可進(jìn)行復(fù)染，脫水，透明。
14）選擇適當(dāng)?shù)姆馄瑒┓馄?br />
2、即用型二步法
1）脫蠟、水化組織切片。
2）根據(jù)所應(yīng)用的一抗的特殊要求，對(duì)組織切片進(jìn)行預(yù)處理。
3) 0.3%或3%H2O2去離子水孵育5分鐘-30分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS或TBS沖洗。
4）滴加一抗，室溫或37℃孵育30~60分鐘，或4℃過夜，PBS或TBS浸洗3分鐘×5次。
5）滴加enhangcer增強(qiáng)劑，37℃30min，PBS或TBS浸洗3分鐘×5次。
6）滴加通用型IgG抗體-Fab段-HRP多聚體，室溫/37℃孵育30分鐘-1h，PBS/TBS沖洗，3分鐘×5次。
7）應(yīng)用DAB溶液顯色。
8）蒸餾水沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片。
總之，免疫組化實(shí)驗(yàn)是一種強(qiáng)大而精確的生物學(xué)研究技術(shù)，它在推動(dòng)醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。
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