1. 組織塊的質量是否良好？

對于CosMx™ SMI單細胞空間組學數據來說，組織塊質量是其中的一個關鍵變量。制作高質量組織塊的兩個關鍵因素是固定和缺血時間。

推薦使用10%的NBF或4%的PFA固定蛋白和RNA組織。由于一次理想的組織固定依賴于固定物在組織中的擴散是否充分，所以推薦的標本厚度為2-3毫米。在這種厚度下，大多數組織類型在室溫下需要至少24小時的固定時間（最多72小時）。較厚的組織切片和組織類型，如骨、血或脂肪組織、含有艾滋病毒的組織和某些胎兒組織可能需要較長的固定時間。組織固定不足會導致樣品降解和形態保存不良。過度固定也應避免，因為它可能導致非特異性背景染色。標本的最佳固定時間往往需要經過摸索而得出。

缺血時間是指某一特定器官或組織被剝奪足夠血液供應，從而失去氧氣和營養的時間。雖然在小鼠研究中通常比在人體研究中更容易控制，但缺血是防止組織損傷和RNA降解的關鍵因素之一。缺血時間越短，RNA質量越好。

通常，我們使用H&E染色來評估組織塊的質量。H&E染色可用于確定組織是否正確固定，以及確認組織質量差的區域，例如厚度不一致，撕裂，褶皺和顫動；同時，通過染色圖也能從病理上確認目的疾病區域是否存在，是否符合研究需要。當在CosMx™ SMI儀器上運行時，此評估還可用于輔助FOV的選擇。

在這里，小編為大家展示幾個H&E染色評估組織塊質量的例子：

(1)  用中性緩沖福爾馬林固定的腎臟石蠟切片。

固定良好的組織，細胞核和細胞質形態良好，收縮最小，基底膜和細胞邊緣清晰。

(2) 用中性緩沖福爾馬林固定的腎臟石蠟切片。

固定不良的組織，細胞核和細胞質形態較差，細胞邊緣過度收縮，界限不清。

(3) 用中性緩沖福爾馬林固定的小腸粘膜石蠟切片。

細胞核和細胞質保存良好，但存在一些細胞收縮。

(4) 小腸粘膜石蠟切片，用95%乙醇固定。

雖然核保存良好，但細胞質和細胞外成分大量萎縮。

一些組織處理或切片質量差的例子：

2.  組織切片質量是否良好？

下游試驗的成功完成取決于切片和載玻片制備過程中的技術。切片的粘附性和厚度的一致性對下游分析性能有影響。在切片這一環節，SBC空間生物學小分隊的伙伴們技術嫻熟，經驗豐富，若您想要開展單細胞空間組學研究，可以放心地將樣本交給我們！

下圖展示了高質量和低質量FFPE切片之間的區別。

3. 是否考慮到組織異質性和自體熒光的問題？

如前所述，我們建議在CosMx™ SMI實驗正式開始之前用連續切片進行H&E染色。該連續切片既可用于評估組織塊質量，也可用于指導FOV圈選。通過恰當的FOV選擇，可以避免選擇低質量的組織區域，聚焦核心研究區域，并減少儀器的運行時間。

選擇組織區域時要考慮科學問題。例如，下圖的研究重點是研究癌癥、肌肉和正常組織，而不是結締組織。FOV所在區域是為了回答研究中的科學問題。左圖顯示了H&E切片，用于指導使用CosMx™ SMI 1K RNA檢測運行的FOV的選擇。同樣覆蓋在右邊圖像上的是每個視場的RNA表達計數。RNA檢出隨著組織形態變化而變化。在結締組織、脂肪組織和粘液中通常觀察到較低的RNA檢出。

盡可能避免將FOV定在組織壞死、剝落、褶皺、皺紋和撕裂處。

組織自身熒光是另一個需要考慮的變量。高的組織自身熒光可能導致更高的背景，并影響細胞分割。在運行期間需要通過選擇正確的預漂白來最大限度地減少自身熒光并提高數據質量。

SBC先后搭建GeoMx® DSP和CosMx™ SMI兩大空間組學研究平臺，并與NanoString攜手共建DSP空間組學“卓越中心”，搭配10x Visium Cytassist以及LCM+timsTOF Pro 4D非靶向深度空間蛋白組平臺，打造空間生物學全鏈條創新多組學平臺及解決方案，助力科學發現。