細胞復蘇實驗的詳細過程說明
細胞復蘇是通過快速融化的手段保證細胞外結冰晶在很短時間內融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞重新結晶對細胞造成損害，復蘇成功的細胞可以保持很高的活力。細胞復蘇的過程需要嚴格的溫度控制，以確保細胞的活力和完整性。一旦溫度過高或過低，都可能對細胞造成不可逆的損傷，影響實驗的順利進行。在操作過程中，科學家們必須全神貫注，如同呵護脆弱的生命之花。
細胞復蘇的原則：快速融化
必須將凍存在-196℃液氮中的細胞快速融化至37℃，使細胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結晶，對細胞造成損害。
實驗前準備：
1.將水浴鍋提前預熱至37℃。
2.細胞實驗室進行常規消毒，用75％酒精擦拭紫外線照射40min的超凈工作臺臺面，保證無菌。
3.在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養瓶等即將使用的耗材及試劑。
一、取出凍存管
1.根據細胞凍存記錄按標簽找到所需細胞的對應編號。
2.從液氮罐中取出細胞盒，取出所需的細胞，同時核對管外的編號。
二、迅速解凍
1.迅速將凍存管投入到已經預熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷地搖動，使管中的液體迅速融化。
2.約1-2min后凍存管內液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內。
三、平衡離心
用架盤天平平衡后，放入離心機中3000r/min 離心3分鐘。
四、制備細胞懸液
1.吸棄上清液。
2.向離心管內加入適量完全培養液，吹打制成細胞懸液。
3.用培養液懸液混懸沉淀細胞，細胞計數調整細胞濃度，放入培養箱中培養。
五、細胞計數
細胞濃度以5×105/mL為宜。
六、培養細胞
將符合細胞計數要求的細胞懸液分裝入培養瓶內，將培養瓶放入37℃，5％CO2的培養箱內2-4h（或者24-48h）后換液繼續培養培養，換液的時間根據細胞情況而定。
七、記錄復蘇日期
八、結果分析：
判斷細胞復蘇成功與否，需要看復蘇后細胞貼壁率及細胞存活率（細胞存活率將凍存管內剩余的細胞，臺盼藍染色法檢測復蘇細胞的存活率。呈藍色的細胞為死細胞，活細胞不著色。用細胞計數板和計數器計數細胞，得出細胞存活率）。
如果復蘇后95%以上的細胞貼壁，而且細胞的活性好，這就說明細胞復蘇的過程沒有問題。復蘇的細胞恢復到正常生長，達到正常的生長特性（比如細胞群體倍增時間等）后要再凍存以補充細胞儲存數量。
注意事項：
1. 實驗前做好準備工作，如預熱水浴鍋、配制并預熱培養基、實驗器材的準備。確保避免因實驗準備不充分導致細胞復蘇失敗。
2. 取細胞時應做好防護措施，帶好防凍手套，護目鏡。細胞凍存管可能漏入液氮，解凍時凍存管中的氣溫急劇上升，可導致爆炸。
3. 若液氮罐距離水浴鍋距離較遠，需要對凍存管進行保冷后轉移到水浴鍋旁，避免路途中導致細胞融化�？捎�-80℃預冷的程序降溫盒轉移細胞，但不可長時間滯留，應盡快化凍復蘇。
4. 細胞放入水浴中注意用鑷子夾住細胞凍存管并在水浴中不時晃動，使其受熱均勻，并防止水浴時水進入細胞凍存管污染細胞。打開細胞凍存管之前要用酒精棉球將凍存管消毒并晾干。
5. 若細胞較珍貴，在吸取細胞時要保留槍頭或移液管，用培養基沖洗上面殘留的細胞。
6. 快速操作的目的：一是防止長時間常溫下DMSO對細胞產生毒性；二是在低溫到常溫的過程中，水分會重新進入細胞并形成冰晶，快速升溫可以使冰晶迅速融化，避免傷害細胞。
7. 離心的主要目的是通過換液取出含有DMSO的凍存液，若細胞對DMSO耐受，可不離心。
細胞復蘇的原則：快速融化
必須將凍存在-196℃液氮中的細胞快速融化至37℃，使細胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結晶，對細胞造成損害。
實驗前準備：
1.將水浴鍋提前預熱至37℃。
2.細胞實驗室進行常規消毒，用75％酒精擦拭紫外線照射40min的超凈工作臺臺面，保證無菌。
3.在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養瓶等即將使用的耗材及試劑。
一、取出凍存管
1.根據細胞凍存記錄按標簽找到所需細胞的對應編號。
2.從液氮罐中取出細胞盒，取出所需的細胞，同時核對管外的編號。
二、迅速解凍
1.迅速將凍存管投入到已經預熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷地搖動，使管中的液體迅速融化。
2.約1-2min后凍存管內液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內。
三、平衡離心
用架盤天平平衡后，放入離心機中3000r/min 離心3分鐘。
四、制備細胞懸液
1.吸棄上清液。
2.向離心管內加入適量完全培養液，吹打制成細胞懸液。
3.用培養液懸液混懸沉淀細胞，細胞計數調整細胞濃度，放入培養箱中培養。
五、細胞計數
細胞濃度以5×105/mL為宜。
六、培養細胞
將符合細胞計數要求的細胞懸液分裝入培養瓶內，將培養瓶放入37℃，5％CO2的培養箱內2-4h（或者24-48h）后換液繼續培養培養，換液的時間根據細胞情況而定。
七、記錄復蘇日期
八、結果分析：
判斷細胞復蘇成功與否，需要看復蘇后細胞貼壁率及細胞存活率（細胞存活率將凍存管內剩余的細胞，臺盼藍染色法檢測復蘇細胞的存活率。呈藍色的細胞為死細胞，活細胞不著色。用細胞計數板和計數器計數細胞，得出細胞存活率）。
如果復蘇后95%以上的細胞貼壁，而且細胞的活性好，這就說明細胞復蘇的過程沒有問題。復蘇的細胞恢復到正常生長，達到正常的生長特性（比如細胞群體倍增時間等）后要再凍存以補充細胞儲存數量。
注意事項：
1. 實驗前做好準備工作，如預熱水浴鍋、配制并預熱培養基、實驗器材的準備。確保避免因實驗準備不充分導致細胞復蘇失敗。
2. 取細胞時應做好防護措施，帶好防凍手套，護目鏡。細胞凍存管可能漏入液氮，解凍時凍存管中的氣溫急劇上升，可導致爆炸。
3. 若液氮罐距離水浴鍋距離較遠，需要對凍存管進行保冷后轉移到水浴鍋旁，避免路途中導致細胞融化�？捎�-80℃預冷的程序降溫盒轉移細胞，但不可長時間滯留，應盡快化凍復蘇。
4. 細胞放入水浴中注意用鑷子夾住細胞凍存管并在水浴中不時晃動，使其受熱均勻，并防止水浴時水進入細胞凍存管污染細胞。打開細胞凍存管之前要用酒精棉球將凍存管消毒并晾干。
5. 若細胞較珍貴，在吸取細胞時要保留槍頭或移液管，用培養基沖洗上面殘留的細胞。
6. 快速操作的目的：一是防止長時間常溫下DMSO對細胞產生毒性；二是在低溫到常溫的過程中，水分會重新進入細胞并形成冰晶，快速升溫可以使冰晶迅速融化，避免傷害細胞。
7. 離心的主要目的是通過換液取出含有DMSO的凍存液，若細胞對DMSO耐受，可不離心。
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