近十年，腫瘤微環境作為腫瘤研究領域的分支之一，在很多方面取得了進展，其重要原因在于腫瘤樣本組織具有與生物復雜性相關的顯著空間異質性。而腫瘤微環境研究可以揭示其中奧秘。

 

多重免疫熒光染色作為腫瘤微環境研究的重要手段之一，可以同時顯示多種生物標志物，實現識別細胞類型，以及研究信號通路和繪制腫瘤微環境中復雜的細胞互作圖譜。

 

盡管近年出現幾種新技術，但在生物標志物發現和診斷領域工作的研究人員和臨床醫生仍然面臨技術瓶頸：1）組織微陣列技術的使用受到腫瘤異質性限制，2）新型多維度空間生物學技術成本高昂。

 

在此背景下，Innopsys 開發了 InnoQuant熒光全玻片掃描儀，其具有經過優化的獨特光學設計，可提供高質量免疫熒光染色圖片，有助于高內涵數據的生成和分析。

 

NSCLC多重組織成像的案例研究

 

研究非小細胞肺癌(NSCLC)中癌癥組織中的免疫浸潤

 

非小細胞肺癌(NSCLC)約占所有肺癌的85%。目前，使用靶向腫瘤特定分子特征的治療藥物已成為標準方案。因此，研究腫瘤組織樣本，以此來表征免疫細胞和免疫檢查點有助于個體化的靶向治療。

 

 

1)PD-L1是一種免疫檢查點標志物，在髓系細胞和腫瘤細胞中表達，并作為癌癥免疫治療的潛在靶點，本實驗中作為腫瘤細胞標志物。

2)顆粒酶B (Granzyme B，GrB)是一種絲氨酸蛋白酶顆粒酶，主要存在于自然殺傷細胞(NK細胞)和細胞毒性T細胞的顆粒中，本實驗中作為NK細胞標志物。

3)CD8存在于T細胞中，本實驗中作為細胞毒性T細胞標志物。

4)使用Cell Signaling 公司mIHC熒光抗體進行非小細胞肺癌樣本染色，具體如下: FITC標記PD-L1，AF594標記CD8，Cy5標記GrB。

 

 

1)利用GrB標記物鑒定NK細胞：采用640 nm激發波長產生Cy5信號，通過680/42 BP濾波器采集其發射信號。

2)利用CD8標記物鑒定T細胞：采用561nm激發波長產生AF594信號，通過593/40 BP濾波器采集其發射信號。

 

 

利用QuPath的深度學習功能，分別識別NK細胞和CD8+ T細胞。采用Delauney聚類特征2D法鑒定NK細胞簇和CD8+ T細胞簇。分析3個相鄰NK或CD8+ T細胞所包圍的三角形面積與 腫瘤區域邊界到NK或CD8+ T細胞中心距離之間的關系。

 

 

冷凍切片厚度:5μm。冷凍切片總面積:97 mm²。4個熒光通道掃描時間:10分鐘。ROI面積:2 mm²（圖1）。

圖1:NSCLC組織切片全圖，mIHC染色，InnoQuant掃描，后續分析ROI用黃色圈出

 

 

圖2中黃色標記區域為腫瘤細胞區域，藍色標記NK細胞分布在腫瘤細胞區域內部和外部。圖中大部分NK細胞集中在腫瘤細胞區域周圍，部分NK細胞在腫瘤細胞區域內。

 

圖2:腫瘤細胞區域微環境中NK細胞簇的ROI和細節（腫瘤細胞區域用黃色標出，NK細胞呈藍色；圖片由InnoQuant獲取，QuPath分析）

 

三個NK細胞間面積（μm²）被定義為由三個相鄰NK細胞圍成的三角形面積。最近腫瘤區域邊界距離（μm）表示NK細胞質心到最近腫瘤細胞區域邊界的距離。如距離為正，則NK細胞位于腫瘤細胞區域外部，如距離為負，則NK細胞位于腫瘤細胞區域內部。

 

對距腫瘤細胞區域不同距離的相鄰三個NK細胞間面積的分析表明，絕大部分相鄰NK細胞形成的三角形面積都在600μm²以下，且與腫瘤細胞區域邊界的距離都在±12μm的范圍內。面積越小，證明NK細胞密度越高，而且都集中分布在腫瘤區域周圍。正如圖2中所看到的，NK細胞的分布受到腫瘤細胞區域的影響，絕大部分NK細胞都圍繞著腫瘤細胞區域（圖3）。

圖3:NK細胞密度與腫瘤細胞區域的關系。左：細胞圍成的三角形面積與細胞和腫瘤邊界之間距離的火山圖。縱軸：3個相鄰NK細胞圍城的三角形面積。橫軸：NK細胞中心與腫瘤邊界的距離。右：分布在腫瘤細胞區域附近的NK細胞數量，按不同距離進行分類

 

圖4中黃色標記區域為腫瘤細胞區域，品紅色標記CD8+ T細胞分布在腫瘤細胞區域內部和外部。圖中大部分CD8+ T細胞集中在腫瘤細胞區域周圍，部分CD8+ T細胞在腫瘤細胞區域內。

圖4:腫瘤細胞區域微環境中CD8+ T細胞簇的ROI和細節（腫瘤細胞區域用黃色標出，CD8+ T細胞呈品紅色；圖片由InnoQuant獲取，QuPath分析）

 

三個CD8+ T細胞間面積（μm²）被定義為由相鄰三個CD8+ T細胞圍成的三角形面積。最近腫瘤區域邊界距離（μm）表示CD8+ T細胞質心到最近腫瘤細胞區域邊界的距離。如距離為正，則CD8+ T細胞位于腫瘤細胞區域外部。如距離為負，則CD8+ T細胞位于腫瘤細胞區域內部。

 

對距腫瘤細胞區域不同距離的相鄰三個 CD8+ T 細胞間面積的分析表明，絕大部分相鄰CD8+ T細胞形成的三角形面積都在600μm²以下，且與腫瘤細胞區域邊界的距離都在±12um的范圍內。面積越小，證明CD8+ T細胞密度越高，而且都集中分布在腫瘤區域周圍。說明正如圖4中所看到的，CD8+ T細胞的分布受到腫瘤細胞區域的影響，絕大部分CD8+ T細胞都圍繞著腫瘤細胞區域（圖5）。

圖5: CD8+ T細胞密度與腫瘤細胞區域的關系。左：細胞圍成的三角形面積與細胞和腫瘤邊界之間距離的火山圖。縱軸：3個相鄰CD8+ T細胞圍城的三角形面積。橫軸：CD8+ T細胞中心與腫瘤邊界的距離。右：分布在腫瘤細胞區域附近的CD8+ T細胞數量，按不同距離進行分類

 

 

無論是NK細胞還是CD8+ T細胞，都受到腫瘤區域的影響，集中分布在腫瘤細胞區域內外，不斷浸潤腫瘤組織。

 

利用全組織掃描成像并結合深度學習算法，可以識別不同免疫細胞以及分析其與腫瘤區域的距離。本案例證明了InnoQuant提供的整張掃描圖像可以在第三方分析軟件中生成相關數據。圖像質量高，可以得到如細胞計數和鄰近分析等統計學分析，以更好地了解患者的特定病理生理狀況。這些空間和定量的數據可用于進一步預測免疫腫瘤領域的治療反應。

Innopsys 成立于1999年。總部位于法國，一直致力于生物醫學領域相關儀器和軟件的自主研發和生產。InnoQuant組織切片/生物芯片掃描儀，采用先進的共聚焦PMT檢測器和多激光掃描光路，可以同時進行多通道熒光檢測。不僅掃描結果清晰，而且無需后續拼接和陰影校正處理，在組織切片和生物芯片掃描領域都有廣泛應用。

 

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