免疫組織化學(IHC)是一種利用抗原抗體特異性結合，檢測和定位組織樣本中特定抗原或分子的技術。由于抗原的位置可提供關于其生物作用及組織完整性、發育階段等信息，因此，IHC具有重要的基礎研究價值，是疾病診斷和腫瘤分期的重要工具。

傳統的IHC實驗使用辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶標記的抗體進行顯色檢測，一次只能在載玻片上檢測到一種抗原。而多重熒光檢測技術（如Sapphire FL激光掃描成像系統）的應用，大大增強了載玻片上的信息獲取，有效提高了診斷的準確性。

同時，Sapphire FL具有5-1000μm可調節的高分辨率，可快速篩選分類，挑選最好的切片進行顯微分析，免于對所有切片進行顯微鏡成像觀測的耗時繁瑣。此外，Sapphire FL獲取的完整載玻片圖像，可對顯微鏡捕獲的小切片圖像進行補充。

— 實驗案例：小鼠肺組織切片的IHC成像 —
使用Sapphire FL，對小鼠肺組織切片進行多重熒光IHC成像，對切片中的兩種抗原進行檢測。

材料與方法
1. 小鼠肺組織的制備
將小鼠肺組織的石蠟塊切片置于載玻片上，60度烘烤45分鐘。組織切片使用二甲苯和乙醇洗滌，進行脫臘、水化。分別使用二甲苯、100%乙醇、95%乙醇、70%乙醇和PBS洗滌2次，每次5分鐘。

2. 抗原修復
脫臘及水化完成后，載玻片在Tris-EDTA Tween®緩沖液(pH 9)中，使用電飯鍋孵育22分鐘。隨后等待20分鐘，使載玻片回至室溫后，在PBS中洗滌兩次，每次10分鐘。

3.免疫檢測
為檢測切片中的血管內皮(VE)鈣粘蛋白和平滑肌肌動蛋白(SMA)，采用兔抗VE鈣粘蛋白和小鼠抗SMA 為一抗。將組織切片在Power BlockTM 中封閉12分鐘。使用含0.5% Triton的PBS緩沖液稀釋一抗：兔抗VE鈣粘蛋白抗體及小鼠抗SMA抗體的稀釋比例分別為1:100和1:200。將載玻片與一抗冷藏孵育過夜。隨后使用TBS洗滌兩次，每次5分鐘，再用TBS- tween®洗滌一次，除去未結合的一抗。

使用熒光標記的二抗，AzureSpectra山羊抗兔550 (Azure Biosystems產品#AC2158) 和AzureSpectra山羊抗鼠650 (Azure Biosystems產品#AC2166)對一抗進行檢測。使用含0.5% TritonTM的PBS緩沖液對二抗進行1:500稀釋。將載玻片置于二抗溶液中室溫孵育1小時。

隨后使用TBS洗滌兩次，每次5分鐘，再用TBS- tween®洗滌一次，洗去未結合的二抗，并蓋上蓋玻片進行成像。

4. 成像
使用532nm和638nm標準光學模塊和擴展動態范圍(EDR)功能，在Sapphire FL上對切片進行成像。聚焦類型選擇Slide，將焦距設置在玻璃成像表面上方+1.00 mm。圖像以5μm分辨率拍攝，質量設置為High（高）。

結果

圖1. 小鼠肺組織切片探測血管內皮（VE）-鈣粘蛋白（紅色，AzureSpectra 550nm二抗）和光滑肌肉肌動蛋白（SMA）（綠色，AzureSpectra 650nm二抗）。使用Sapphire FL激光掃描成像系統在532nm和638nm通道下成像，分辨率5μm。

圖1顯示了Sapphire FL拍攝的多重熒光IHC實驗圖像。載玻片中的小鼠肺組織切片，使用VE-cadherin和SMA進行探針檢測，并使用兩種熒光標記的二抗進行檢測。VE-cadherin使用Sapphire FL 532nm標準光學模塊檢測，在圖像中顯示為紅色。SMA使用Sapphire FL 638nm標準光學模塊檢測，在圖像中顯示為綠色。在5μm分辨率圖像中可很容易地觀察到組織形態。在圖1中，肺組織區域被放大，局部SMA染色可更詳細地可視化。

結論
使用Sapphire FL可對熒光標記的腫瘤，輕松實現可視化。同時對于未被標記的腫瘤，也可實現高品質的成像檢測。

Sapphire FL具有集成的麻醉端口，搭配合適的導管和鼻錐，即可實現活體小鼠的麻醉成像；高達4cm的樣品倉，支持小鼠、植物、培養皿及其它大型生物樣品成像。除熒光成像外，Sapphire FL還可靈活實現近紅外熒光、磷屏、化學發光及可見光的多功能成像應用，賦能實驗室多樣化、更深入的科研需求！