一、介紹
鱟試劑（LAL）測定法是藥典中用于檢查藥品（如USP <85>章所述）、加工材料和藥用級水中細菌內毒素的檢測方法。

對于任何生物測試，測試結果都容易受到分析條件變化的影響。在這里，鱟試劑測定法即使作為生物測定法，也具有相對較高的變異性^[1]。這種變化主要來自3個方面：試劑、產品和方法^[2]。本文以光度法（顯色法和比濁法）為重點，探討了造成鱟試劑檢測差異的一些原因，并研究了如何通過良好的實驗室質量控制來評估差異。

二、鱟試劑測試的變異性
鱟試劑檢測的不同方面都會造成差異。這些方面包括鱟試劑、內毒素對照標準、標準曲線和稀釋誤差。我們將依次對這些方面進行研究。

（一）鱟試劑
鱟試劑會導致檢測結果的差異，原因如下：
鱟試劑（鱟溶解物）來源于生物，是多種酶和輔助因子的復雜混合物。該提取物是相對粗糙的混合物，不是單一的純化酶，這意味著無法準確測定每批裂解物的酶活性。

生產過程中會添加緩沖劑和洗滌劑，這也是造成差異的一個原因。

制造商使用美國藥典提供的參考標準內毒素（RSE）對每批鱟試劑的酶活性進行評估，通過進行2倍稀釋系列來評估鱟試劑的靈敏度。用于表征裂解液的RSE因其稀有性和昂貴性，并非所有檢測實驗室都能輕易獲得，所以實驗室通常使用細菌內毒素工作標準品（CSE）。CSE的效力由鱟試劑供應商根據RSE評估CSE來確定。這就增加了測試差異的可能性。

（二）細菌內毒素
檢測中使用的內毒素會導致差異，這是因為：
實驗室中用于制備細菌內毒素工作標準品（CSE）的內毒素來自純化的大腸桿菌菌株。CSE是一種高度純化的脂多糖，不含大多數可檢測的污染物（如蛋白質）。CSE含有額外的穩定填充劑，如淀粉、人血清白蛋白和聚乙二醇。然而，環境內毒素未經純化，通常以脂多糖、細胞膜蛋白和磷脂的大分子復合物的形式存在，這些物質由革蘭氏陰性細菌在生長和死亡過程中脫落。因此，根據純化內毒素標準測定環境內毒素時存在差異^[3]。

此外，盡管鱟試劑檢測對內毒素具有特異性，但它只能檢測內毒素分子中可用于激活裂解物的脂質A部分（凝血級聯反應的激活，因子C通路，如下所述）^[4]。內毒素分子的脂質A部分可能形成未完全分散的聚集體，因此不夠均勻，無法進行準確的總測量。

因此，檢測到內毒素的樣品不一定能顯示出樣品中的所有內毒素，因為這取決于脂質A的含量，所以檢測到內毒素的樣品可能會被低估。此外，檢測到內毒素的樣本在重復檢測時可能不會顯示出相同水平的內毒素，因為隨著時間的推移，樣本的化學性質和穩定性會發生變化，脂質A的可用性也會隨之改變。還應注意的是，不同類型的環境內毒素的毒性和反應性有所不同，這取決于脂質A分子對不同細菌種類的生物活性。

（三）鱟試劑檢測法的變異性
鱟試劑檢測法固有的變異性為50%至200%（或每個內毒素標準兩側各有一個2倍誤差）。對于動力學測定法，變異性源于內毒素標準曲線的斜率^[5]。

檢測變化可能來自一系列測試輸入，包括：
●試管
●一次性移液器吸頭
●微量移液器吸頭

針對上述情況，BET測試中使用的塑料（例如微量滴定板、塑料稀釋管）通常不是專門為內毒素檢測而制造的。
●無菌技術
●分析技術
●移液方法的差異
●制備控制標準品的差異
●稀釋液配制過程中的變化（如果錯誤發生在系列中的第一個稀釋中，則差異會放大）

長期儲存的稀釋液會發生變化。可變因素包括溫度、容器成分、稀釋范圍和稀釋體積）。
●交叉污染
●產品或樣品干擾
●取樣容器
●樣品儲存時間和溫度
●LAL儀器/模塊變化——不同的儀器可能會產生不同的結果
●產品中存在內毒素（內毒素分子表現不同或脂質A的可用性不同）
●添加緩沖液以穩定pH值

輔助溶液可能不含內毒素。

上述某些問題與檢測技術人員的操作直接相關（如稀釋液的配制、移液、原材料的稱重和無菌技術等）。

（四）內毒素濃度
隨著標準系列使用的內毒素濃度變小，誤差的顯著性也會增加。例如，標準曲線為1.0至0.1 EU/mL時，50%至200%的誤差將比5.0至0.005 EU/mL的標準系列產生的影響較小，這是因為標準系列中最后一個內毒素濃度值較小。也許正是由于這些原因，藥典中列出的測試對照品的可接受加標回收率為50%至200%。

（五）稀釋誤差
測試稀釋時可能會出現錯誤，特別是在稀釋內毒素和繪制標準曲線時。為避免在繪制標準曲線時出現稀釋誤差，建議采取以下控制措施：

每批內毒素或裂解物在常規使用前，應由3名技術人員對稀釋系列進行鑒定，每次對稀釋系列進行3次驗證。每個接受過該試驗培訓的新技術人員都要進行類似的操作。

對于常規檢測，不同試驗的稀釋順序不應有差異（即，始終進行相同類型的稀釋）。

內毒素的起始濃度應始終保持相同（通常為1000EU/mL）。內毒素標準曲線是根據相同的內毒素起始濃度（1000EU/mL）繪制的。這一點可通過查看生產商的分析證書進行驗證，也可通過比較使用中的對照標準內毒素和參考標準內毒素（均為大腸桿菌O113:H10的純化提取物）對生產商的證書進行確認測試。

盡管如此，在上述情況下，如果進行測試的技術人員出了差錯，仍有可能發生稀釋錯誤。

（六）標準曲線線性關系
標準曲線的一致性是鱟試劑檢測的一個重要特征。線性標準曲線的y軸截距僅發生1%的變化，就會導致內毒素測定值發生30%至35%的變化。因此，已知10EU/mL的樣品可能讀數為13.5EU/mL，這并不是因為樣品中的內毒素含量發生了變化，而是因為y-截距發生了變化。控制濁度法鱟試劑檢測變異性的一個重要方法是密切關注起始（反應）時間。這些起始時間看似微小的變化都會導致線性、斜率和y軸截距的變化，從而對檢測結果產生重大影響^[6]。

三、評估差異
雖然可以采取措施減少變異，但根據良好質量控制的原則，實驗室應該有監督和評估的手段，以確定檢測結果是否令人滿意，以及變異是否過大到足以引起關注的程度。其中一種方法就是審查變異系數（CV）。

（一）變異系數的應用
變異系數是精確度的衡量標準。分析程序的精確度是指單個檢測結果之間的一致程度（或者，用檢測術語來說，是指當分析程序重復應用于單一、同體積生物基質的多個等分試樣時，單個分析物測量結果的接近程度）^[7]。變異系數是以平均值的百分比表示的標準差。當不同樣本之間的平均值增加時，變異系數值就可以用來測量變異性。

通常，變異系數表示為測試重復之間的百分比（%CV）。這可以應用于標準曲線點和測試樣品復制。對于鱟試劑，常見的要求是CV≤10%或≤25%（取決于裂解物供應商設定的要求）。百分比變異系數越低，說明不同測試副本之間的精確度越接近（與平均值的“散差”相對較小）。

計算CV有不同的方法。這些方法與計算標準差的不同方法有關。一旦采用了標準差的計算方法，CV就可以表示為標準差與平均值之間的比率。

由此，可以計算出%CV值：
100% ×（標準差/算術平均數）

從上式可以看出，CV轉換為百分比的方法是將得到的數字乘以100，得出%CV值^[8]。

在評估鱟試劑檢測時，根據EU/mL的測量值計算出的%CV值通常會隨著內毒素濃度的降低而增加，因為較高濃度的內毒素通常可獲得<10%的值，而較低濃度的內毒素（通常接近標準曲線的末端并接近檢測限）可獲得10%到30%的值。

在此需要指出的是，不同的鱟試劑供應商對鱟試劑檢測有不同的驗收標準，并通過軟件包以不同的方式計算其%CV值。例如，有些供應商根據以每毫升內毒素單位（EU/ mL）表示的結果來計算變異系數；而有些供應商則根據樣品的起始時間（以毫吸光為單位）來計算變異系數^[9,10]。

（二）檢測稀釋錯誤
除變異系數外，稀釋誤差也需要評估。為了檢查鱟試劑檢測是否正確，應檢查標準曲線上內毒素濃度最高點的反應時間，確保其在以秒為單位的預期時間范圍內。這一點非常重要，因為這些起始時間看似微小的變化會導致線性度、斜率和Y-截距的變化，從而對測試結果產生重大影響^[11]。

為此，需要檢查起始內毒素濃度的起始時間（如5.0 EU/ml）。這需要對歷史數據進行研究，以確定典型范圍。為了提高準確性，建議對使用內毒素進行的前100次測試進行評估。如果稀釋液的制備出現錯誤，那么起始時間將超出預期范圍。

檢測起始時間是檢測誤差的一個重要指標，因為它直接關系到光度法LAL檢測方法的工作方式。采用動態濁度法或顯色法進行LAL檢測時，裂解液（等分到反應管中）會與等分樣品或標準曲線稀釋液中的任何內毒素發生反應^[12]。所發生的反應是根據時間測量濁度或顏色的變化。達到濁度閾值（在預先設定的光學范圍內以毫吸光度單位測量）的時間越快，內毒素濃度就越高。這一起始時間范圍不僅因內毒素水平而異，而且不同批次的裂解液和對照標準內毒素也會有所不同。

起始時間必須在正確的范圍內，因為它可以確定已進行了正確的稀釋。舉例來說，如果測試的稀釋方法不正確，相關系數和報告的內毒素值看起來仍然是正確的。這是因為相關系數是實際值與預期值之間的最佳擬合線，而軟件會解釋這些數據，并通過從標準系列中推斷出估計的內毒素濃度^[13]。

根據平均值的第二個標準偏差，可以計算出起始濃度的光密度達到所需閾值所需的時間范圍。 鑒于LAL檢驗本身存在誤差（通常認為誤差為±25%），為了與其他生物檢驗方法保持一定程度的標準化，第二個標準差可以說是最合適的測量方法。標準差是衡量單個元素偏離平均值（均值）的程度。其計算公式為方差的平方根（如圖1所示）。
 

使用平均值的2個標準差表明95%的值落在上下限范圍內。除此之外的5%代表非典型值。

每次LAL檢驗完成后，記錄最高內毒素濃度（曲線起點）的起始時間都要與這一范圍進行比較，只有當測得的起始時間在這一范圍內時，才可認為檢驗是合格的。如果出現稀釋錯誤，那么起始時間就會超出預期的時間范圍。

通過采用平均值的2個標準差，任何超出計算范圍的測試值都被視為非典型值，不能代表正常人群。因此，需要對LAL測試進行調查。作為進一步檢查技術員工作表現的一種方法，區域主管可對每位技術員標準曲線的起始時間進行趨勢分析和檢查。

（三）標準曲線相關系數
還可以對標準系列的線性度進行額外的檢查。為此，應檢查每次測試的標準曲線的相關系數（要求相關系數大于或等于0.980）。藥典要求每次測試都要進行這項檢查。

標準曲線的一致性是LAL檢驗的一個重要特點。線性標準曲線的Y-截距只要變化 1%，就會導致內毒素測定結果變化30%至35%。因此，已知為10 EU/mL的樣品，讀數可能為13.5 EU/mL——這不是因為樣品中的內毒素含量發生了變化，而是因為y-截距發生了變化^[6]。

（四）陰性對照
每次檢測都應進行陰性對照。陰性對照是用于構建標準曲線的水樣。陰性對照樣品可顯示在制備內毒素系列時是否發生了污染。對照組的內毒素含量必須低于標準曲線中的最低內毒素濃度（常規標準系列為0.05EU/mL）。這項檢查是藥典要求的。

四、總結
本文探討了影響 LAL 檢測的一些變化來源。對于實驗室用戶來說，了解這些因素非常重要，尤其是在設計檢測方法和調查檢測異常時。文章還考慮了一個衡量變異性的關鍵指標：變異系數。這是實驗室主管在審查測試結果時需要進行的一項重要檢查。

參考文獻
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