傳統的病理診斷方法在腫瘤研究中一直占據著重要地位，但隨著醫學的發展，其局限性也日益凸顯。傳統的病理診斷主要基于對H&E染色組織的二維觀察，它的觀察區域相對狹窄，并且只能提供平面的二維圖像，難以全面觀察組織結構，特別是對于大病理標本，可能會遺漏一些病變。

為了克服傳統方法的局限性，科研人員一直在尋求能夠獲取組織三維圖像的有效方法。其中，連續切片成像技術是早期的嘗試之一。早在20世紀60年代末和70年代，就有相關研究將大體圖像與相應6-8μm厚度的組織切片進行匹配。如今，通過對連續切片組織進行計算機處理成像，可以生成重建的3D圖像，從而能夠觀察到活檢標本中諸如乳腺癌等病變的三維結構。然而，這種基于切片的方法由于組織切片不可避免的不連續性，無法實現對組織結構的完美連續觀察。盡管它能夠呈現病變的大致結構，如腫瘤體積、腫瘤結節分支以及腫瘤內部是否存在腔隙等，但要獲得這樣的重建3D圖像，需要數百張來自連續切片組織的玻片，這無疑是一個成本高昂且勞動密集的過程。

組織透明化技術在近年來取得了顯著進展�；�于的方法三類，這些技術大致可分為疏水試劑、親水試劑和水凝膠，它們各自具有不同的特點。其核心原理是通過化學或物理的方法使組織或器官透明，以便光線能夠穿透深層組織，從而利用共聚焦熒光顯微鏡、多光子熒光顯微鏡和光片熒光顯微鏡等各種光學顯微鏡獲取體積圖像。在一些病理研究中，組織透明化和3D成像技術已經展現出了獨特的優勢。例如，在糖尿病小鼠的整個胰腺3D圖像中，能夠定量評估胰島的體積和數量；在人類自閉癥患者中，可以量化由神經突形成的異常梯形結構；在阿爾茨海默病的小鼠模型和人類患者的大腦中，還能夠對β-淀粉樣斑塊的分布、結構、異質性以及與神經膠質細胞和血管的空間關系進行定量分析。

此外，其他研究小組也在正常和患者來源的組織中展示了3D觀察的優勢，并對其與石蠟包埋或H&E染色的兼容性進行了測試。盡管這些技術具有潛在的應用價值，但在實際應用中，它們大多僅應用于少量的病理樣本，尚未有研究能夠全面證明它們對臨床病理檢查的靈敏度和特異性有實質性的改善作用。

整體組織透明成像技術對組織的處理效果
1、組織透明化
整體組織透明成像作為一種親水的組織透明化和3D成像技術，展現出了出色的性能。在對各種人體器官進行測試時，研究人員發現它對人肺和淋巴結組織的透明化效果尤為顯著，其效率可與小鼠器官相媲美。具體來說，從甲醛固定的人體大腦、心臟、肺、肝、腎、脾、腸和淋巴結中切取2-5mm厚的組織塊，按照既定的整體組織透明成像處理協議進行操作。結果顯示，肺和淋巴結組織在經過整體組織透明成像處理后，變得高度透明，且在釋放整體組織透明成像試劑后，通過PBS清洗，可以順利地進行石蠟包埋、切片和H&E染色。對染色后的切片進行觀察，發現整體組織透明成像處理對組織造成的損傷極小，如果有的話，也可以忽略不計。這表明整體組織透明成像技術應用于病理標本時，不會對后續的H&E染色產生不利影響，而H&E染色在醫院的常規病理診斷中是必不可少的。

此外，整體組織透明成像處理還能夠保留一些診斷標志物的抗原性，如在肺和淋巴結組織中的細胞角蛋白、α-SMA、CD68、CD79a和CD3等。這意味著病理學家在組織經過整體組織透明成像處理后，仍然可以進行免疫組織化學染色，以實現更準確的診斷。這一結果與之前對整體組織透明成像處理的小鼠乳腺腺組織的研究結果一致。對于其他器官，如腦、心、肝、腎、脾和腸等，雖然整體組織透明成像試劑對它們的透明化效果不如肺和淋巴結，但經過研究發現，經過脫蠟處理后的石蠟包埋組織可以用于整體組織透明成像處理。這為在更多類型的組織中應用整體組織透明成像技術提供了可能。

2、3D成像
整體組織透明成像技術不僅在組織透明化方面表現出色，在3D成像上也取得了重大突破。在對正常組織的研究中，以人肺組織為例，研究人員首先按照整體組織透明成像處理協議對組織塊進行處理，然后使用抗α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）抗體進行免疫染色，并使用細胞可滲透的綠色熒光核酸染料SYTO16對細胞核進行復染。通過共聚焦顯微鏡和光片熒光顯微鏡對處理和染色后的肺組織樣本進行成像。結果顯示，共聚焦顯微鏡獲得的重建3D圖像成功地可視化了包括支氣管分支網絡、血管系統和間質纖維在內的詳細3D組織結構。通過免疫組織化學染色的抗α-SMA抗體，還能夠選擇性地標記穿過間質空間的血管網絡。而且，當組織經過整體組織透明成像處理后，能夠觀察到至少400μm深的肺組織結構，而在未進行組織透明化處理時，最大只能檢測到150μm深處的零散熒光信號。

同時，共聚焦顯微鏡的tile掃描工具還能夠在相同分辨率下對更大面積的組織進行成像。除了肺組織，研究人員還對其他人體組織，如淋巴結和心臟冠狀動脈進行了類似的處理、染色和成像操作。通過光片熒光顯微鏡獲得的重建3D圖像展示了各個組織的宏觀解剖特征，如肺組織中的肺泡、支氣管和血管網絡，淋巴結中的淋巴濾泡以及心臟冠狀動脈的外周分支。此外，通過鬼筆環肽進行的肌動蛋白染色，還能夠幫助選擇性地標記人腦皮層表面的小動脈，并在重建3D圖像中清晰地顯示出來。這些結果充分證明了整體組織透明成像技術在正常組織3D成像中的有效性和廣泛適用性。

在對病理組織的研究中，整體組織透明成像技術同樣展現出了強大的功能。例如，在對肺淀粉樣變性患者的組織研究中，為了可視化血管壁上的淀粉樣蛋白沉積，將患者在常規病理診斷后剩余的肺組織塊進行整體組織透明成像處理和整體剛果紅染色。剛果紅染色在常規病理診斷中常用于淀粉樣蛋白染色，與H&E染色配合使用。

研究發現，即使在經過整體組織透明成像處理后，剛果紅染色仍然能夠有效地發揮作用，組織塊中的淀粉樣蛋白沉積在標本中宏觀可見。通過共聚焦顯微鏡或光片熒光顯微鏡對處理和染色后的樣本進行3D成像，能夠清晰地看到血管壁上的管狀淀粉樣蛋白沉積。使用硫黃素T染色也能夠獲得類似的圖像。這表明整體組織透明成像技術能夠實現對病理標本的3D成像，為病理診斷提供更直觀、更詳細的信息。

在腫瘤病理診斷中的應用
1、細胞異型性分析
對于腫瘤病理診斷來說，準確分析細胞的異型性是至關重要的。研究人員以石蠟包埋的惡性淋巴瘤組織為對象，展示了整體組織透明成像技術在這方面的應用價值。惡性淋巴瘤是一種起源于淋巴組織的腫瘤，在組織病理學上具有異常的形態特征，如組織結構紊亂（結構異型性）、細胞核形態改變（核異型性）以及惡性細胞的大小和形狀的多變性（多形性）。由于淋巴瘤細胞的細胞質較少，因此核異型性和多形性在惡性淋巴瘤的診斷中尤為重要。為了測試這些特征是否能夠通過3D成像進行觀察和量化，研究人員從石蠟包埋的組織塊中使用直徑為4mm的活檢打孔器取出組織，以盡量減少組織的損失。然后對取出的組織進行整體組織透明成像處理、成像和分析。

通過光片熒光顯微鏡獲得重建3D圖像和代表性的二維光學切片圖像，發現惡性淋巴瘤細胞呈現出彌漫性浸潤模式，這反映了其結構異型性。同時，在淋巴瘤標本中，通過鬼筆環肽染色的浸潤性成纖維細胞的肌動蛋白纖維在局部可見，這有助于評估淋巴瘤細胞侵襲所導致的纖維化程度。在經過整體組織透明成像處理后的常規H&E染色切片圖像與這些組織病理學特征一致。

此外，通過共聚焦顯微鏡獲得的更高分辨率的圖像能夠更精確地顯示細胞的核酸形態，與正常淋巴細胞相比，淋巴瘤細胞顯示出核異型性和多形性，其細胞核形狀和大小更加不均勻。通過對堆疊圖像進行統計分析，進一步證實了淋巴瘤細胞在核形狀上的異常，如核尺寸增加、核圓形度降低（核異型性）以及這些參數的更大方差（核多形性）。這些結果表明，整體組織透明成像技術可以應用于臨床標本石蠟包埋檔案中的3D病理檢查，為腫瘤細胞異型性的分析提供了一種新的有效方法。

2、淋巴結轉移篩查
腫瘤的淋巴結轉移是影響患者預后的重要因素，因此準確檢測淋巴結轉移情況對于腫瘤的治療和診斷至關重要。在本研究中，研究人員采用了基于整體組織透明成像的篩查方法對結直腸癌手術中的淋巴結進行檢測，展示了整體組織透明成像技術在淋巴結轉移篩查中的優勢。在實驗中，研究人員使用了來自結直腸癌手術患者的淋巴結樣本，這些患者至少有一個淋巴結通過常規診斷方法被診斷為轉移陽性（>pT1）。將甲醛固定的淋巴結切成兩半，一半按照常規病理診斷方法進行石蠟包埋、切片和H&E染色，并在最大切面上進行組織學評估；另一半則進行整體組織透明成像篩查，即先進行整體組織透明成像處理，然后使用Alexa Fluor 647-共軛的抗細胞角蛋白抗體進行免疫染色，最后通過光片熒光顯微鏡進行成像，并對可疑信號進行基于切片的組織學評估，以獲得最終診斷。

在對74個淋巴結的檢測中，研究人員通過整體組織透明成像這種篩查方法，發現有4個淋巴結僅通過整體組織透明成像被新診斷為陽性轉移。通過與常規病理診斷方法對比，計算出常規診斷方法的靈敏度為85.2%（23/27），有4個假陰性。而整體組織透明成像將靈敏度提高到了100%（考慮到篩查中的假陰性已通過深切片排除）。這表明整體組織透明成像能夠提高檢測轉移癌結節的靈敏度，為腫瘤淋巴結轉移的診斷提供了更準確的方法。

研究結果
整體組織透明成像技術可以成功地應用于臨床病理診斷過程中。它不僅能夠對石蠟包埋組織進行有效的處理和3D成像，而且在處理過程中不會損害組織的抗原性，不會影響后續的常規病理檢查，如H&E染色。這使得整體組織透明成像技術能夠與傳統的病理方法兼容，為在臨床實踐中廣泛應用提供了可能。

在腫瘤病理診斷中，整體組織透明成像技術展現出了獨特的優勢。通過對惡性淋巴瘤組織的研究，它能夠對腫瘤細胞的異型性進行量化分析，為腫瘤的診斷提供了更客觀、更準確的依據。同時，在淋巴結轉移篩查方面，整體組織透明成像能夠提高檢測的靈敏度，有助于更早地發現腫瘤的轉移情況，從而為患者的治療提供更及時、更有效的指導。

整體組織透明成像技術的應用有助于回顧性和前瞻性臨床病理診斷。在回顧性診斷方面，它能夠對石蠟包埋的病理組織進行重新評估，挖掘出更多關于腫瘤細胞異型性等方面的信息。在前瞻性診斷中，它能夠提高對淋巴結轉移等關鍵病理特征的檢測靈敏度，為腫瘤的早期診斷和治療提供支持�？傮w而言，整體組織透明成像技術能夠提高臨床病理診斷的客觀性、定量性和敏感性。它為病理學家提供了一種全新的工具，能夠更全面、更深入地了解腫瘤組織的結構和特性，從而做出更準確的診斷。

展望未來
盡管整體組織透明成像技術取得了顯著的成果，但仍然存在一些需要進一步改進和研究的方向。 在染色方法方面，雖然目前整體組織透明成像技術與多種抗體和染色劑兼容，但在染色效率和效果上還有提升空間。特別是對于3D組織中染色劑、抗體或探針的有效滲透，目前只有少數關鍵參數被確定。未來需要建立一種簡單而強大的基于擴散滲透的染色方法，或者進一步識別基于小分子的染色試劑，如短肽和核酸（如適體），以提高染色效果和效率。

在組織透明化效率方面，雖然整體組織透明成像試劑對肺和淋巴結組織的透明化效果較好，但對于其他器官，如腦、心、肝、腎等，還需要進一步提高其透明化效率。這可能需要對整體組織透明成像試劑進行優化升級，或者尋找更有效的組織透明化和脫色化學試劑。

此外，對于一些含有內源性色素的組織，如含有黑色素的組織，目前還沒有有效的處理方法，這也是未來需要解決的問題。 總之，整體組織透明成像技術為腫瘤病理成像帶來了新的突破和希望。隨著未來研究的不斷深入和技術的不斷完善，相信它將在腫瘤病理診斷領域發揮更加重要的作用，為人類健康事業做出更大的貢獻。

聲明：本文僅用作學術目的。文章來源于：Satoshi Nojima,Etsuo A. Susaki, Kyotaro Yoshida, Hiroyoshi Takemoto,Naoto Tsujimura, Shohei Iijima, Ko Takachi, Yujiro Nakahara, Shinichiro Tahara, Kenji Ohshima, Masako Kurashige, Yumiko Hori, Naoki Wada, Jun-ichiro Ikeda, Atsushi Kumanogoh, Eiichi Morii & Hiroki R. Ueda;CUBIC pathology: three-dimensional imaging for pathological diagnosis;2017 Aug 24;7(1):9269. doi: 10.1038/s41598-017-09117-0.