創新組織透明技術在無標記腦成像的應用
科學家一直期望在不破壞組織的前提下看清大腦內部結構，光學成像技術是重要手段，但大腦中的脂質和細胞外基質會強烈散射光線，使獲取高分辨率厚組織圖像困難重重。在這種情況下，基于FxClear的組織透明化技術為大腦成像帶來希望，有望突破現有困境，幫助我們更清晰地認識大腦，開啟探索大腦奧秘的新篇章。
研究背景與技術挑戰
厚組織成像的“絆腳石”
在光學顯微鏡下對厚組織進行高分辨率成像一直是個難題。大腦組織的復雜性是成像的一大障礙，其中的脂質和細胞外基質是“罪魁禍首”。脂質在大腦中廣泛存在，特別是在白質區域，其富含的髓鞘脂質使得光線散射嚴重。
為了克服這些困難，組織透明化技術應運而生。通過各種方法減少光線散射，讓大腦變得“透明”起來，以便更好地觀察內部結構。目前已有多種組織透明化技術，大多數是基于物理策略來降低光線散射。比如，通過去除脂質這一主要的光線散射源，然后將組織浸泡在折射率匹配介質中，減少組織成分的不均勻性。然而，這些技術并非十全十美。
不同組織對這些技術的反應各不相同，以大腦的灰質和白質為例，由于白質含有豐富的脂質髓鞘，其組織透明化效率與灰質存在差異。而且，組織的大分子含量和排列具有獨特性，這使得其光學性質因組織類型和狀態而異，這些因素對組織透明化效果的影響程度也不盡相同。研究表明，在大多數組織中，折射率匹配對組織透明化效果的影響最大，這意味著組織細胞外基質的性質可能是影響組織清晰度的關鍵因素。但現有技術在處理不同組織時，很難精準地平衡各種因素，以達到理想的透明化效果。
標記成像的困境與無標記成像的需求在腦成像研究中，免疫染色的體積成像雖然在許多實驗中取得了成功，但獲得均勻染色的厚樣本卻并非易事，而且染色過程可能會對組織的原有結構和功能產生影響。因此，無標記成像技術的需求日益迫切，可以在不引入外部標記的情況下，直接觀察組織的結構和變化，避免了標記帶來的潛在干擾。基于折射率差異的無標記成像技術具有很大的潛力，光學相干斷層掃描（OCT）就是其中一種重要的成像技術，能夠識別生物組織的固有散射特性，廣泛應用于正常和病理組織結構的無標記檢測。然而，OCT系統價格昂貴，并非所有實驗室都能配備，而且利用傳統光學顯微鏡進行厚組織的無標記成像研究相對較少，這也為該領域的發展帶來了挑戰。
技術創新與應用
FxClear技術的核心“武器”
FxClear技術是本研究的核心，主要通過洗滌劑對組織進行脫脂處理。與其他脫脂方法不同的是，FxClear技術不會將脂質完全去除，而是保留了一定比例的脂質，這一特點反而成為了它的優勢。在大腦組織中，這種不完全脫脂使得白質和灰質之間的對比度增加，巧妙地加深了某些區域的顏色，讓畫面的層次更加分明。
研究人員發現，不同的折射率匹配介質對組織成像有著顯著影響。他們選擇了果糖和碘克沙醇等化合物作為折射率匹配介質，這些化合物具有高水溶性和合適的折射率范圍。實驗結果顯示，當調整匹配溶液的折射率時，ACT和FxClear技術處理的樣本中，灰質和白質的透明度對比度會發生變化。在FxClear技術處理的樣本中，灰質和白質的透明度受折射率值的影響更為明顯，且灰質與白質的透明度比值更大。
進一步研究不同的折射率匹配試劑發現，即使調整所有介質的折射率相同，由于脫脂程度和介質種類的不同，樣本的透明度也會有顯著差異。其中，碘克沙醇表現出最高的灰質與白質比值，能夠為小鼠腦1mm連續切片的神經束可視化提供足夠的對比度，在透射光顯微鏡或立體顯微鏡下都能清晰觀察到神經束。
不同脫脂方法的“大比拼”
為了驗證其他脫脂方法是否適用于無標記成像，研究人員選擇了CUBIC和iDISCO這兩種常用的組織透明化方法。實驗結果表明，CUBIC和iDISCO處理的腦切片雖然具有較高的組織透明度和灰質與白質對比度，但CUBIC處理的切片對比度明顯不如FxClear技術或iDISCO處理的切片。這說明不同的脫脂方法各有優劣，FxClear技術在提供高折射率對比度方面具有獨特的優勢，能夠為標記成像提供更好的基礎。
FxClear技術在病理研究中展現出了強大的能力。研究人員利用該技術對創傷性腦損傷（TBI）、阿爾茨海默病（AD）等病理模型進行研究。結果發現，優化后的FxClear能夠在TBI后3天就敏感地識別出損傷區域。對于AD模型，研究人員發現該技術能夠清晰地顯示出AD小鼠腦中的淀粉樣β（Aβ）斑塊。在透射光成像中，剛果紅標記的Aβ斑塊區域呈現出暗斑，與周圍組織區分開來。這表明FxClear技術能夠有效地識別病理特征，為相關疾病的研究和診斷提供了有力的工具。
成像實驗與結果分析
光學成像“工具包”大顯身手
為了全面評估FxClear技術的成像效果，研究人員使用了多種光學成像技術，包括傳統的透射光顯微鏡、立體顯微鏡，以及先進的光學相干斷層掃描（OCT）和光學相干顯微鏡（OCM），還有基于自發熒光的選擇性平面照明顯微鏡（SPIM）。
傳統顯微鏡下的“新發現”
在傳統的透射光顯微鏡和立體顯微鏡下，FxClear處理的樣本展現出獨特的成像效果。通過調整折射率匹配介質，研究人員能夠清晰地觀察到小鼠腦切片中灰質和白質的差異，以及神經束的分布。在高對比度的成像下，神經纖維束的走向和結構一目了然，不同的折射率匹配介質能夠突出不同的組織特征，為研究人員提供了更多觀察和分析的角度。
OCT和OCM技術為研究人員提供了更深入的信息。在OCT圖像中，經過折射率匹配的腦切片，灰質和白質的對比度比未匹配的切片更加明顯。通過測量光的穿透深度和對比度發現，FxClear處理結合折射率匹配能夠顯著提高成像深度和質量。OCM成像則能夠更清晰地顯示樣本中的纖維束結構，OCM成像呈現出最清晰、對比度最高的纖維束圖像。
SPIM的“立體呈現”
基于自發熒光的SPIM技術為研究人員帶來了全新的視角。使用自制的SPIM系統，研究人員成功對FxClear處理的整個半腦切片小鼠腦進行成像。在高分辨率成像下，小腦、海馬體和胼胝體中的纖維投射結構以及大腦皮層中的血管都清晰可見，發現一些在之前基于折射率成像中不太明顯的特征，為大腦結構的研究提供了更全面的信息。
成像結果的“量化分析”
為了更準確地評估成像效果，研究人員對各項指標進行了量化分析。在組織透明度方面，通過測量不同處理樣本的透明度，發現不同的脫脂方法和折射率匹配介質對組織透明度有顯著影響。例如，在比較FxClear、CUBIC和iDISCO處理的樣本時，發現它們的透明度和灰質與白質的對比度存在明顯差異。
在OCT成像中，對光穿透深度、對比度等指標進行量化分析，結果表明FxClear處理結合碘克沙醇折射率匹配能夠提供最佳的對比度和足夠的成像深度，滿足無標記成像的需求。這些量化數據為FxClear技術的有效性提供了有力的證據，讓研究結論更加科學可靠。
總結與展望
FxClear技術為腦科學研究提供了簡單可靠的無標記成像方法，可清晰觀察大腦結構和病理變化，助力神經科學和病理學研究，推動神經系統疾病機制探索與早期診斷。在臨床診斷領域，其無標記成像特性有助于更簡便獲取大腦信息，為腦損傷和退行性疾病診斷、治療方案制定提供依據。然而，FxClear技術存在局限，難以識別細胞異質性，且自制成像系統不利于結果比較。未來，需結合其他技術增強細胞層面信息獲取能力，開發標準化設備與方法，為生命科學發展帶來新突破。
論文信息
聲明：本文僅用作學術目的。
Lee B, Lee E, Kim JH, Kim HJ, Kang YG, Kim HJ, Shim JK, Kang SG, Kim BM, Kim K, Kim Y, Cho K, Sun W. Sensitive label-free imaging of brain samples using FxClear-based tissue clearing technique. iScience. 2021 Mar 5;24(4):102267.
DOI:10.1016/j.isci.2021.102267.
