在生物醫學領域，了解微觀世界的奧秘對于攻克疾病、探索生命本質至關重要。光學成像技術作為重要的研究手段，不斷推陳出新。其中，新型多光子成像技術近年來發展迅猛，為科研人員和醫療工作者提供了更為強大的觀測工具。它能夠深入活體組織內部，獲取高分辨率的圖像，幫助我們窺探細胞和組織的細微結構與動態變化。

研究背景與技術挑戰
傳統光學成像的局限
傳統光學成像技術在生物醫學研究和臨床診斷中發揮了重要作用，但也存在諸多局限性。例如，在觀察深層組織時，光的散射和吸收會導致成像質量下降，分辨率降低，難以清晰呈現組織內部的微觀結構。而且，傳統成像技術可能對組織造成較大的光損傷，影響細胞的正常生理功能，干擾研究結果的準確性。這些局限限制了我們對生物體內復雜過程的深入理解，迫切需要新的成像技術來突破這些瓶頸。

多光子成像技術的興起
隨著科學技術的不斷進步，多光子成像技術應運而生。它基于多光子吸收原理，與傳統成像技術相比，具有獨特的優勢。多光子成像能夠有效減少光散射和吸收，降低組織光損傷，提高成像的信噪比，并且具備良好的光學層析成像能力，為生物醫學研究帶來了新的希望。接下來，我們將詳細介紹幾種新型多光子成像技術。

技術創新與應用
微型化雙光子熒光成像技術
技術原理與發展歷程：微型化雙光子熒光成像技術是為滿足對神經系統在體研究的需求而發展起來的。神經系統結構復雜，研究其活動需要在盡量保持其完整性的情況下進行成像。雙光子熒光成像利用近紅外光激發，具有深組織穿透性、光學切片能力以及較小的光毒性和光漂白等優勢，成為無創在體腦顯微成像的首選。第一臺微型化雙光子顯微鏡原型機于2001年問世，采用單模光纖尖端掃描，但存在質量重、掃描頻率受限和難以批量生產等問題。2006年，微機電系統（MEMS）掃描鏡被引入，一定程度上改善了性能，但仍存在無法對重要熒光探針成像和實際工作性能不佳等問題。

攜帶式雙光子顯微鏡
最新進展與優勢：北京大學程和平課題組報道的高速高分辨微型化雙光子顯微鏡（FHIRM-TPM）代表了該技術的最新進展。它采用MEMS掃描鏡設計，對配件進行改進和創新，這款顯微鏡重量僅2.15g，橫向分辨率和軸向分辨率分別提升約一倍，能有效激發常用熒光指示劑，可在小鼠活躍運動狀態下長時間穩定工作。

應用領域：微型化雙光子顯微鏡主要用于腦成像，能夠在動物自由活動狀態下研究神經活動，為神經科學研究提供了有力工具。未來，它有望拓展應用于更多組織成像，通過更換物鏡適應不同成像需求，還可與微創方法結合實現更深層腦成像，或借助新興三光子技術提升成像效果。

雙光子光纖內窺成像技術
技術優勢與分類：雙光子光纖內窺成像技術為早期癌癥局部微創診斷提供了新途徑。雙光子激發只發生在焦點附近，激發光波長更長，散射更少，能穿透更深標本，提高圖像對比度，還可通過分析非線性信號了解內部器官生理、病理變化。該技術的內窺鏡按光纖類型分為單模光纖（SMF）、光子晶體光纖（PCF）和雙包層光纖（DCF）。單模光纖最早應用，但存在脈沖變寬和難以收集非線性信號的缺點。光子晶體光纖能提高激發光束傳遞和非線性信號采集效率，雙包層光纖便于實現內窺鏡微型化。

掃描裝置與發展成果：研究者通過改良掃描裝置提高成像速度和質量，多種微型掃描機構已被應用。隨著技術發展，雙光子內窺成像在科研和臨床應用中取得較大進展，如對癌細胞成像、大腦深部成像、上皮組織成像以及對大鼠食管組織和尾腱成像等。

最新進展與應用前景：2017年，Liang WX等人實現了具有亞細胞層次分辨率的光纖內窺平臺，可對活體內生物組織進行無標記雙光子代謝成像。該裝置在光纖、物鏡和激發效率等方面進行改進，提高了檢測靈敏度、空間分辨率和圖像質量，整體信噪比提高20-50倍。它能夠監測急性小鼠腎缺血再灌注體內模型中腎皮質小管的氧化還原率變化，展現了高分辨率和高靈敏度。未來，雙光子光纖內窺成像技術將朝著提高成像速度和信噪比的方向發展，在臨床實踐中的應用也將更加廣泛。

三光子成像技術
發展歷程與原理：三光子成像技術的發展經歷了漫長過程。研究者們很早就觀察到三光子吸收激發熒光現象，1979年Catalano等人對無機材料的三光子非線性光學性質進行定量分析，1995年Davey等人在有機高分子聚合物溶液中觀察到三光子激發熒光現象并提出應用設想。隨后，一系列研究驗證了三光子成像的能力，但受光源技術和成本限制，發展較為緩慢。直到2013年，Horton等人報道了使用基于孤子自頻移（SSFS）光源的三光子顯微鏡，使三光子成像取得重要突破。

與雙光子成像的比較：與雙光子成像相比，三光子成像使用波長更長的激發光源，成像深度更大。這是因為長波激發光在組織中的散射更低，且1600-1800nm的激發光可避開組織中水對紅外光的吸收峰。同時，三光子吸收需要更高激光能量，能進一步削弱非焦平面的背景信號，提高信號-背景比（SBR），獲得更高質量圖像。不過，三光子成像也存在缺陷，如對高能激發光需求導致設備成本和技術難度增加，強激光可能對組織造成損傷。

應用領域與發展方向：目前，三光子成像主要應用于活體組織高分辨成像和光遺傳學研究等領域，未來有望應用于臨床光學治療。為克服現有缺陷，研究人員正通過開發新型熒光染料、尋找合適激光光源和優化探測器等方法，提高三光子成像深度、分辨率和信號強度。

成像實驗與結果分析
微型化雙光子顯微鏡的成像實驗
微型化雙光子顯微鏡（如FHIRM-TPM）在腦成像實驗中表現出色。在對小鼠的研究中，它能夠清晰捕捉小鼠活躍運動狀態下神經元的活動情況。通過有效激發熒光，科研人員可以觀察到神經元的形態和功能變化，為研究神經回路的動態過程提供了直觀的數據。與傳統臺式雙光子顯微鏡相比，FHIRM-TPM的高分辨率和高掃描速度，使其能夠更精準地記錄神經元活動的時空信息，有助于深入理解神經系統的工作機制。

雙光子光纖內窺成像實驗
雙光子光纖內窺成像技術在生物組織代謝成像方面成果顯著。以對急性小鼠腎缺血再灌注體內模型的研究為例，通過無標記雙光子內窺技術監測腎皮質小管的氧化還原率變化。實驗結果顯示，缺血時NADH濃度增加，氧化還原比下降，再灌注后恢復正常。從成像圖像中可以清晰看到，缺血后紅色區域氧化還原比下降，再灌注后紅色區域變成綠色，直觀展示了雙光子內窺顯微成像的高分辨率和高靈敏度，為研究腎臟生理病理過程提供了有力依據。

三光子成像實驗
三光子成像技術在大腦成像實驗中展現出獨特優勢。使用基于SSFS光源的三光子顯微鏡對小鼠大腦進行成像，可以無損地看到大腦灰質之下的白質。與雙光子成像相比，三光子成像能夠穿透更深的組織，獲得更清晰的深層結構圖像。在對神經元和腦血管的成像中，三光子成像的高SBR使得圖像中的細節更加豐富，有助于研究人員深入了解大腦的結構和功能關系，為神經科學研究開辟了新的視角。

總結與展望
新型多光子成像技術在生物醫學領域意義重大。微型化雙光子成像技術讓科學家能在動物自由活動時研究神經系統，為解開大腦奧秘提供關鍵數據，推動神經科學發展，未來有望拓展到更多組織成像，幫助理解多種生理病理過程。雙光子內窺成像技術可實現無創或微創的體內檢測，提高疾病早期診斷準確性，降低患者痛苦和醫療成本，未來提高成像速度和信噪比后，將在臨床廣泛應用，助力疾病早篩和精準治療。三光子成像技術憑借大成像深度和高SBR，在研究深層組織和細胞結構功能方面優勢明顯，隨著技術完善，有望為臨床光學治療提供新方法，提高治療效果。

論文信息
聲明：本文僅用作學術目的。
石玉潔, 張廣杰, 陸政元, 應亞宸, 賈薈琳, 席鵬. 新型多光子成像技術研究進展[J]. 中國光學（中英文）, 2018, 11(3): 296-306. 
DOI:10.3788/CO.20181103.0296.