大腦結構的尺度跨越極大，從納米級的突觸到厘米級的整個大腦，要想全面解析大腦的連接奧秘，就需要一種能夠跨越多個空間尺度的成像技術。日本聯合研究團隊在《iScience》發表了突破性成果，研究人員開發出一種結合組織透明化方法（ScaleSF）與連續光鏡/電鏡（LM/EM）成像的多尺度神經元成像技術首次實現了從全腦宏觀觀察到突觸納米結構解析的無縫銜接，為揭示神經環路的跨尺度組織規律提供了革命性工具。

研究背景與技術挑戰
在神經連接組學研究領域，光鏡與電鏡技術長期處于割裂狀態。熒光標記技術結合組織透明化方法（如CUBIC、CLARITY）雖能實現全腦尺度的神經元追蹤，但受光學衍射極限制約，無法確認直徑僅300納米的突觸連接。而基于連續切片電鏡的技術雖能重建突觸級連接，卻因成像通量限制僅能分析毫米級組織塊。這種技術鴻溝導致研究者無法在同一樣本中同時獲取神經環路的拓撲結構與突觸連接特性。更嚴峻的是，傳統透明化方法使用的強去垢劑會破壞細胞超微結構，而電鏡兼容的固定劑戊二醛又會淬滅熒光信號，使得多尺度成像的技術整合舉步維艱。

技術創新與應用
研究團隊通過三重技術突破構建了多尺度成像體系。首先開發的ScaleSF透明化方法，在保持樣本尺寸穩定的前提下，將1mm厚腦片的透光率提升至90%以上，其次設計的雙模態探針，通過酪胺信號放大系統在透明化處理后仍保持強電鏡對比度，軸向標記分辨率達250nm。最后構建的高效表達系統使探針在神經元胞體與軸突末梢的標記強度提升4.7倍，支持從全腦追蹤到單突觸解析的連續觀測。

該技術體系成功應用于三個典型神經環路研究。在小鼠紋狀體-蒼白球通路中，研究人員首次通過連續成像證實了紋狀體投射神經元的無髓鞘特性；狨猴皮層-紋狀體環路的全腦成像則揭示了靈長類特有的突觸分布規律；最引人注目的是小鼠胼胝體環路研究，證明了該技術在稀疏連接解析中的獨特優勢。

成像實驗與結果分析
成像實驗設計
在驗證多尺度成像技術可行性的實驗中，研究人員精心設計了一系列實驗方案。他們選擇了小鼠紋狀體傳出系統、小鼠胼胝體系統以及狨猴皮質紋狀體投射系統作為研究對象。這些系統在大腦功能中具有重要作用，且其神經連接的復雜性和多樣性能夠充分檢驗成像技術的性能。

為了實現對不同尺度結構的精準追蹤，研究人員采用了多種標記方法。利用GFP和RFP熒光、DAB-Ni²標記以及大腦結構形狀、血管和細胞核等內源性標志物，確保在不同成像尺度下都能準確識別和追蹤目標結構。同時實現了光鏡和電鏡數據集的明確關聯。

小鼠紋狀體傳出系統成像結果
以小鼠紋狀體傳出系統為模型，研究人員展示了多尺度成像技術的強大功能。在實驗中，他們將攜帶載體注射到小鼠的尾狀核-殼核（CPu）。四周后，對大腦進行固定、透明化處理，并利用共聚焦激光掃描顯微鏡進行宏觀和中尺度神經回路映射。結果清晰地觀察到EGFP標記的纖維從CPu延伸到腦干，在蒼白球外側部（GPe）和黑質（SN）形成密集的終末場。

進一步對感興趣的神經元進行重新切片和高分辨率成像，詳細記錄了標記神經元的形態。在GPe神經元的樹突上，研究人員確認了對稱突觸的存在，其特征為缺乏突觸后致密物（PSD）和狹窄的突觸間隙。這一結果不僅驗證了成像技術在解析神經回路和突觸連接方面的準確性，還為深入研究紋狀體傳出系統的功能提供了重要的結構基礎。

小鼠胼胝體系統成像結果
小鼠胼胝體系統的成像實驗聚焦于胼胝體對新皮質中間神經元的突觸輸入。在對透明化腦切片進行共聚焦激光掃描顯微鏡成像時，研究人員觀察到EGFP標記的軸突從小鼠初級運動皮層穿過胼胝體，投射到對側皮層，與標記的PV中間神經元相互作用。通過仔細篩選大量的連續圖像，他們發現了胼胝體軸突終末與PV新皮質中間神經元樹突之間的一個接觸點。經過重新切片、復染和成像，證實了這個接觸點確實形成了突觸連接，且為不對稱突觸，具有典型的PSD結構。這一結果展示了多尺度成像技術在捕捉稀缺突觸接觸方面的卓越能力，為研究大腦半球間的信息傳遞提供了新的視角。

狨猴皮質紋狀體投射系統成像結果
為了驗證多尺度成像技術在大型哺乳動物大腦研究中的有效性，研究人員以狨猴為模型，對其皮質紋狀體投射系統進行成像。宏觀全腦成像顯示，APEX2表達標記出了神經元聚集區域。對透明化的腦切片進行成像，清晰地觀察到EGFP標記的軸突從初級軀體感覺皮層（S1）延伸到皮層下，并在殼核形成密集的終末場。重新切片后進行微觀亞細胞成像，詳細記錄了標記神經元的形態，包括錐體神經元的胞體、樹突和軸突投射。最后，通過成像在納米尺度下觀察到了突觸結構，如不對稱突觸。這些結果表明，多尺度成像技術能夠在狨猴大腦中實現從宏觀到微觀的有效成像，為研究靈長類動物大腦的神經連接提供了有力工具。

總結與展望
ScaleSF技術體系的建立標志著神經成像技術進入多尺度融合的新紀元。其核心突破在于打破了組織透明化與超微結構保存的互斥困境，這種技術整合使研究者首次能在同一標本中完成腦區連接圖譜繪制與突觸類型鑒定，為解析神經環路的空間編碼機制提供了關鍵工具。在轉化應用層面，該技術特別適用于退行性疾病研究，例如在帕金森病模型中同步追蹤黑質多巴胺能神經元的大尺度退變過程與突觸超微結構改變。未來，技術優化將聚焦三個方向：開發全腦透明化方案以獲取完整投射信息，目前1mm切片導致長程連接追蹤完整度僅68%；建立多色標記體系，通過APEX2變體實現不同神經元類型的突觸特異性標記；結合AI圖像分析，構建從全腦到突觸的自動化重建流程。隨著相關技術的持續突破，有望在五年內實現厘米級哺乳動物腦的完整連接組解析，最終揭開意識與認知的物質基礎之謎。

論文信息
聲明：本文僅用作學術目的。
Furuta T, Yamauchi K, Okamoto S, Takahashi M, Kakuta S, Ishida Y, Takenaka A, Yoshida A, Uchiyama Y, Koike M, Isa K, Isa T, Hioki H. Multi-scale light microscopy/electron microscopy neuronal imaging from brain to synapse with a tissue clearing method, ScaleSF. iScience. 2021 Dec 27;25(1):103601.

DOI:10.1016/j.isci.2021.103601.