生物力學研究在揭示細胞功能調控、組織發育和疾病機制中具有不可替代的作用。傳統力學檢測技術依賴物理接觸或外力加載，難以實現非侵入式三維動態觀測。布里淵顯微鏡（Brillouin microscopy，BM）的出現帶來了新的希望。近期，發表于《Nature Methods》的一項研究成果，更是為布里淵顯微鏡技術帶來了重大突破，首次實現了對斑馬魚幼體、線蟲胚胎等光敏感生物樣本的高分辨率長時間觀測，為活體生物力學研究開辟了新路徑。

研究背景與技術挑戰
生物力學研究的關鍵意義
過去幾十年，生物力學領域致力于解開機械力、材料特性和生化信號之間的復雜關系。這些因素緊密協作，共同調控著細胞的功能和組織的有序構建。例如，細胞所處微環境的力學性質會顯著影響細胞的增殖、分化和遷移等關鍵行為。在腫瘤的發展過程中，癌細胞所處微環境的力學變化會促使癌細胞更具侵襲性，導致腫瘤的擴散。然而，現有的生物物理技術大多依賴直接物理接觸，需要對樣本施加外力來進行測量。這種方式存在明顯的局限性，一方面只能獲取樣本表面的信息，另一方面缺乏在三維空間中對細胞進行高分辨率觀測的能力，無法滿足對生物樣本微觀力學特性深入研究的需求。

布里淵顯微鏡技術嶄露頭角
布里淵顯微鏡作為一種新興的光學彈性成像技術，為生物力學研究帶來了新的契機。當布里淵顯微鏡與共聚焦顯微鏡結合后，具備了三維衍射極限分辨率，在生物研究領域展現出廣泛的應用前景，涵蓋了從活細胞內生物力學研究到疾病診斷等多個方面。

傳統技術的困境
盡管布里淵顯微鏡前景光明，但傳統的自發布里淵散射面臨著信號微弱的難題。為了克服這一障礙，受激布里淵散射（SBS）技術應運而生，實現了高光譜分辨率和高機械特異性，同時縮短了生物樣本的采集時間。然而，目前的SBS技術也并非完美無缺。通常要求樣本相對透明、厚度小于100-200μm，并且需要從兩側進行光學訪問，這限制了其適用范圍。此外，現有的SBS需要較高的泵浦功率。高功率照明不僅會導致樣本加熱，產生光毒性，影響樣本的生理狀態，還限制了對光敏樣本的長時間成像，使得其在生命科學領域的廣泛應用受到阻礙。因此，開發一種能夠克服這些局限性的新技術，成為了生物力學研究領域的迫切需求。

技術創新與應用
脈沖SBS技術原理剖析
為了解決傳統SBS技術的不足，研究團隊提出了脈沖泵浦-探測方法。從原理上看，在連續波泵浦和探測方案中，SBS信號與泵浦和探測光的平均功率乘積以及相互作用時間成正比；而脈沖方案則有所不同，其信號與脈沖峰值功率的平方以及脈沖寬度成正比。在平均功率相同的情況下，脈沖方案的有效增強因子E與占空比成反比。這意味著在相同激光功率下，脈沖方案能夠獲得更高的信噪比（SNR）。利用這一優勢，在保持相同信噪比和探測功率的同時，可以大幅降低泵浦功率，從而減少對樣本的光損傷，為對光敏生物樣本的成像提供了可能。

實驗裝置與優化細節
研究團隊精心搭建了一套脈沖SBS顯微鏡系統。泵浦和探測激光在進入樣本前，分別要經過一系列復雜的光學處理過程。為了使系統性能達到最佳，研究人員對多個關鍵參數進行了仔細優化，經過這些優化，該系統在低照明劑量下，也能實現與傳統連續波SBS相當的信噪比、光譜分辨率、圖像質量和成像速度，為后續的實驗研究奠定了堅實基礎。

技術優勢與潛在應用領域
脈沖SBS技術展現出了諸多顯著優勢。首先，在降低照明功率方面成效顯著，與傳統連續波SBS相比，能實現超過10倍的功率降低，極大地減少了光毒性，使得對各種光敏生物樣本進行長時間成像成為現實。其次，該技術具備較高的空間分辨率和光譜分辨率，能夠精準區分樣本中不同的力學成分，為深入研究生物樣本的微觀力學特性提供了有力手段。

在細胞生物學中，可以幫助研究人員深入探究細胞內不同細胞器的力學性質，以及這些性質在細胞生理和病理過程中的變化；在發育生物學方面，能夠實時監測胚胎發育過程中組織和器官的力學動態變化，助力揭示胚胎發育的奧秘；在疾病研究領域，有助于發現疾病發生發展過程中組織力學性質的改變，為疾病的早期診斷和治療提供新的生物標志物和潛在靶點。

成像實驗與結果分析
小鼠細胞成像
研究團隊率先對小鼠細胞進行了布里淵成像實驗，將脈沖SBS成像結果與準連續波照明下的圖像進行對比。結果令人驚喜，脈沖SBS獲取的布里淵頻移圖呈現出高圖像質量和良好的信噪比。借助這一技術，研究人員能夠清晰分辨出核仁等具有細微力學差異的亞細胞結構。通過對光譜數據的深入分析，還可以繪制出布里淵頻移、增益和線寬的空間圖，進一步展示了該技術的高成像質量和信噪比。

為了評估脈沖SBS對細胞活力的影響，研究人員用碘化丙啶（PI）對細胞進行染色檢測。結果顯示，脈沖SBS成像15小時后，細胞未出現膜和染色體損傷。而連續波SBS成像雖然能獲得類似的對比度和質量，但卻出現了明顯的光損傷跡象。同時，細胞不同區域（核仁、核質和細胞質）的布里淵頻移整體升高，這表明樣本可能因光照而發熱。這些實驗充分表明，在基于SBS的單細胞成像中，將總照明水平控制在低功率對于確保細胞活力至關重要，而脈沖SBS技術在這方面具有明顯優勢。

活體斑馬魚和秀麗隱桿線蟲成像
研究團隊對受精后3天的活體斑馬魚幼體尾部進行了低功率脈沖SBS成像。斑馬魚幼體尾部圍繞脊索的區域包含一層超薄且機械剛性高的細胞外基質（ECM），對組織結構起著關鍵的支撐作用。脈沖SBS圖像清晰地呈現出了包括ECM、脊索和周圍肌肉節段（包括脊髓區域）在內的多種組織類型。了更好地分析多峰布里淵光譜，研究團隊開發了定制的分析方法和GPU增強擬合管道。借助這些工具，他們在分析ECM區域時，發現了布里淵頻移的三峰分布，分別對應ECM周圍組織成分以及ECM的兩種聲學模式。此外，在脊髓中央管區域，研究人員觀察到雙峰布里淵光譜，分別對應腦脊液和可能的搏動纖毛。這一結果表明，脈沖SBS能夠在衍射極限焦體積內和活體內精準識別不同的生物力學成分，為研究活體組織的力學特性提供了有力支持。

還對年輕成年期的野生型秀麗隱桿線蟲進行了成像研究。結果顯示，在照明功率降低10倍的情況下，仍能獲得相似的信噪比和整體對比度。在對秀麗隱桿線蟲性腺區域的高分辨率成像中，發現減數分裂核的布里淵頻移在卵母細胞成熟過程中降低。早期卵母細胞核中，較低布里淵頻移的核質圍繞著較高布里淵頻移的核仁，而在晚期卵母細胞中，核質和核仁區域的布里淵頻移均降低。這種布里淵頻移的變化與染色質從早期到晚期卵母細胞的壓實增加密切相關。此外，對活體小鼠胚胎的成像實驗表明，脈沖SBS能夠獲得高質量的圖像和亞細胞細節，而連續波SBS的高功率會捕獲胚胎，導致無法進行成像。這些結果進一步證明了脈沖SBS技術在活體生物成像方面的優勢和潛力。

小鼠乳腺類器官成像
研究團隊對小鼠乳腺上皮類器官進行了成像研究。在類器官發育的不同階段（接種單細胞后48小時、70小時和80小時）進行成像后發現，上皮組織和細胞在橫向和軸向橫截面中都能清晰分辨。通過量化布里淵線寬，研究人員觀察到類器官管腔在發育早期（48小時）到晚期（70小時和80小時）線寬出現了約200MHz的短暫降低。這一現象與類器官管腔形成過程中的多種生物學過程有關，包括細胞分裂、膜泡內吞以及離子通道和泵在頂膜積累導致的靜水壓力變化等。在80小時的成熟類器官中，軸向橫截面圖像顯示側上皮的布里淵頻移比上皮的上、下帽高100MHz。總體而言，脈沖SBS成像后類器官仍保持活力，表明該技術在研究類器官發育和功能方面具有重要的應用價值。

秀麗隱桿線蟲胚胎成像
作為脈沖SBS技術低光毒性和可視化動態組織特性能力的最終展示，研究團隊對受精后約300分鐘至480分鐘的秀麗隱桿線蟲胚胎進行了縱向和二維力學信息成像。在這個胚胎發育的關鍵時期，組織形態發生開始，大多數細胞分裂已經完成。研究團隊在視野內，以13分鐘的時間間隔獲取二維布里淵時間序列圖像。通過分析這些時間序列數據，發現胚胎不同部位和發育階段的布里淵頻移存在明顯差異。在胚胎形態發生過程中，較高的布里淵頻移標記了胚胎的后部，主要由將形成腸道的內胚層細胞組成。在平均激光功率約27mW的情況下，未觀察到光損傷或光毒性，所有成像的胚胎都經歷了抽搐和正常發育，最終孵化成有活力的幼蟲。這與標準連續波SBS（約265mW）形成鮮明對比，連續波SBS在獲取少數二維圖像后就會導致胚胎損傷和死亡。這充分表明脈沖SBS技術在研究胚胎發育過程中的力學變化方面具有顯著優勢，為深入理解胚胎發育的力學機制提供了新的有力工具。

總結與展望
脈沖激發布里淵顯微鏡的突破，首次實現了對光敏感樣本的長時程、高分辨觀測，其27mW的安全功率閾值（相當于手機閃光燈1%的強度）徹底改變了活體成像的游戲規則。在斑馬魚脊索中發現的三重聲學模式、線蟲胚胎發育的力學時序圖譜、以及乳腺類器官管腔形成的粘彈性演變，這些突破性成果預示著生物力學研究正從靜態描述邁向動態機制解析。未來，與光學衍射層析技術的結合，將實現復雜模量的絕對定量，建立從分子聚集到組織彈性的完整力學模型。臨床轉化方面，該技術已展現出透過小鼠顱骨檢測腦組織病變的潛力，或將成為阿爾茨海默病早期診斷的新利器。

論文信息
聲明：本文僅用作學術目的。
Yang F, Bevilacqua C, Hambura S, Neves A, Gopalan A, Watanabe K, Govendir M, Bernabeu M, Ellenberg J, Diz-Muñoz A, Köhler S, Rapti G, Jechlinger M, Prevedel R. Pulsed stimulated Brillouin microscopy enables high-sensitivity mechanical imaging of live and fragile biological specimens. Nat Methods. 2023 Dec;20(12):1971-1979. doi: 10.1038/s41592-023-02054-z. Epub 2023 Oct 26. Erratum in: Nat Methods. 2024 May;21(5):922.

DOI:10.1038/s41592-024-02259-w.