引言

蝦青素被稱為“抗氧化之王”，其抗氧化能力是維生素的550倍，兼具抗癌、增強免疫力、保護心血管等多重功效。

天然提取蝦青素需消耗大量水資源和土地且產量有限，而生物合成面臨規模化生產的問題。預計全球蝦青素市場到2030年供需缺口將達1-1.5萬噸，中國缺口約3,000-5,000噸。如何提升生物合成蝦青素效率成為填補缺口的關鍵。

圖1.紅發夫酵母結晶紫染色后的光鏡圖

本實驗采用野生型的紅法夫酵母，相較于基因編輯菌，野生菌在天然構型安全性、市場合規性上更具競爭力，但通常野生型菌株的產量較低。

發酵設備使用高通量平行生物反應器+一次性罐體的工藝系統組合，進行工藝參數的快速優化，最終在培養溫度20℃，pH 4.5，發酵119h后蝦青素含量達到了327.73mg/L，蝦青素的含量提高了7.6 倍，培養周期縮短了70h（預實驗中培養基優化篩選中發酵189h,蝦青素含量42.91mg/L）。驗證了這套系統能夠用于野生紅法夫酵母菌株高產蝦青素的快速優化培養。

材料與方法

菌株：
紅法夫酵母：菌株編號GDMCC 2.218；
來源：廣東省微生物菌種保藏中心。

實驗設備：
CloudReady^® + Endura SUB^® 0.5L 一次性罐體×8-（迪必爾生物）；Arc HPLC（Waters）

圖2.CloudReady^®云平臺生物反應器8聯（一次性罐體）

軟件系統：
D2MS(設備和數據管理系統, Device & Data management system）Pro

實驗場所：
迪必爾生物 應用技術與工程研究中心（CARE）

實驗過程

培養基：
初始培養基和補料培養基，由預實驗（培養189h，蝦青素產量為42.91mg/L）結果優化獲得。如表1所示。

表1 實驗培養基

工藝條件設置：
（1）溫度梯度的優化實驗
首先選用4臺CloudReady^® 預先進行溫度梯度的優化實驗，4個反應器分別標記為R1a，R2a，R3a，R4a。具體各罐臺參數條件設置如下表所示。

表2 溫度梯度優化實驗工藝參數設置

（2）pH梯度的優化實驗
選用另4臺CloudReady^®進行pH梯度的優化，四個罐臺分別標記為R1，R2，R3，R4。

為了縮短優化周期，在初次預設值的實驗進行到了第3d的時候，繼續本次實驗測試，為節約準備時間罐體采用一次性罐體（如圖3所示）。具體各罐臺參數條件設置如表3所示。

圖3.Endura SUB^® 一次性罐體

表3 pH梯度優化實驗工藝參數設置

蝦青素測定方法：
（1）紅法夫酵母蝦青素的處理，選用酸熱法^[2]。
（2）紅法夫酵母蝦青素的分析：采用HPLC法進行分析測試^[3]。

液相設備：色譜條件為Waters XBridge^® C18柱 (4.6×50mm)；流動相為甲醇-水(95:5)；流速為1mL/min；檢測波長為475nm。

實驗結果與分析
（1）溫度梯度的優化實驗
按照表1的工藝條件設計， 如圖4所示，R1a和R2a罐臺菌體生長緩慢，在培養到46.4h的時候下罐放棄培養。R3a和R4a罐臺繼續培養到168h后放罐。如圖5所示，其中R3a罐臺在培養到118h有最優的實驗結果，OD₆₀₀ 24.84，其中蝦青素的含量為88.76mg/L,比預實驗的蝦青素的含量提高了，培養周期縮短了71h（預實驗中培養基優化篩選中, 發酵189h,蝦青素含量42.91mg/L）。

圖4.R1a-R4a罐臺批次生長曲線

圖5.R1a-R4a蝦青素的生長曲線

（2）pH梯度的優化實驗
按照表2的工藝條件設計，如圖6所示，其中R1罐臺在pH3.5的條件下菌體生長緩慢，培養到46h后做放罐處理。其它罐臺生長正常，繼續培養到144h，如圖7所示，其中R3罐臺在培養到119h有最優的實驗結果，OD₆₀₀ 35.8，濕重84.1g/L，其中蝦青素的含量為327.73mg/L，在短時間優化后快速的將蝦青素的含量提高了7.6倍，培養周期縮短了70h（預實驗中培養基優化篩選中, 發酵189h,蝦青素含量42.91mg/L）。

圖6.R1-R4批次生長曲線
圖7.R1-R4罐臺蝦青素生產曲線

（3）如圖8所示，隨著培養過程的進行，蝦青素的含量也在快速的生產，發酵菌液的顏色也由淺黃色慢慢的變成深紅色。

圖8.蝦青素生產的罐體局部放大圖

總結
本次研究利用了CloudReady^®云平臺生物反應器高通量平行、智能化、可拓展的優勢，以及Endura SUB^®一次性罐體與玻璃罐高度一致性、顯著提升工藝開發和優化效率的特點，在21天的時間里實現了蝦青素產量7.6倍的提升。

未來，隨著菌株改造、智能算法優化（AI動態調控）的深化，蝦青素生產成本有望進一步降低，推動其在食品、醫藥、護膚等領域的規模化應用。

參考文獻
[1] 姜文濤,韓麗影,等. 產蝦青素紅法夫酵母的發酵工藝優化[J]. 飼料博覽,2021, 12: 13-18.
[2] 李賢宇,肖冬光. 紅法夫酵母細胞內蝦青素的提取方法研究[C].2005年工業微生物研討會，2005:501-506.
[3] 饒毅,曾戀情,等.高效液相法測定蝦青素的含量[J].江西中醫藥大學學報,2014,26(5):86-88.

注：本文實驗數據及圖片版權歸迪必爾生物工程（上海）有限公司所有，未經授權禁止轉載。
原文作者：應用技術與工程研究中心（CARE）石興利。