原代肝細胞分離提取的實驗方法、流程與結果
Keywords：原代肝細胞；Primary Hepatocytes; 肝細胞分離；肝細胞提取; Hepatocyte Isolation Protocol；Isolation of Primary Hepatocytes
肝臟作為藥物暴露的主要器官，在藥物的代謝和毒性過程中起著至關重要的作用。原代肝細胞（Primary Hepatocytes）具有完整的細胞特性和生理水平的酶和輔助因子，既包括膜結合酶【如細胞色素P450（Cytochrome P450）混合功能氧化酶】，也包括胞質酯酶，擁有肝臟中所有的代謝途徑。因此，原代肝細胞（Primary Hepatocytes）被廣泛認為是構建體外肝臟模型的金標準，在藥物相互作用、藥物代謝和藥物毒性研究中受到研究者的青睞。
一、原代肝細胞分離方法
肝細胞分離（Isolation of Primary Hepatocytes）和肝細胞提取提取有直接剪切法、組織塊培養法、胰蛋白酶消化法、兩步膠原酶灌注法（Seglen灌注法）、半原位膠原酶灌注法等。
【直接剪切法】
原理：將肝臟切成小塊，然后用膠原酶或胰蛋白酶進行消化，分離得到肝細胞。
優點：操作簡單，適用于大量細胞的分離。
缺點：細胞損傷較大，純度較低。
【組織塊培養法】
原理：將肝臟切成小塊，在培養皿中加入含特定生長因子的培養液進行培養，使組織塊貼壁生長，然后逐漸分離得到肝細胞。
優點：能夠保持細胞的天然狀態，適用于長期培養。
缺點：操作較為繁瑣，細胞數量較少。
【胰蛋白酶消化法】
原理：用胰蛋白酶或胰酶對肝臟進行消化，分離得到肝細胞。
優點：能夠較為徹底地分解細胞間物質，獲得較純的肝細胞。
缺點：胰蛋白酶的價格較貴，成本較高。
【兩步膠原酶灌注法（Seglen灌注法）】
原理：用含有膠原酶的溶液通過門靜脈灌注到肝臟中，使肝實質細胞與間質分開，然后收集分離得到肝實質細胞。
優點：能夠保持細胞的天然狀態，適用于長期培養。
缺點：操作較為繁瑣，細胞數量較少。
【半原位膠原酶灌注法】
原理：將肝臟放置在特定裝置中，通過門靜脈灌注膠原酶溶液，使肝臟在生理狀態下進行消化，然后收集分離得到肝實質細胞。
優點：能夠較為真實地模擬生理狀態，獲得的細胞形態、活性較好。
缺點：操作較為復雜，成本較高。
其中，兩步膠原酶灌流法因其對肝細胞損傷作用較小，肝細胞產率和存活率高，成為了分離原代肝細胞的經典方法。
二、原代肝細胞分離流程
鑒于此，IPHASE作為體外研究生物試劑引領者，在兩步膠原酶灌注的基礎上，開發了原代肝細胞分離試劑盒，有標準的分離流程（Hepatocyte Isolation Protocol），其內整合了包括灌流液、膠原酶、細胞洗滌液、細胞純化液、試驗耗材等在內的所有組分，可適用于大鼠、小鼠等多個種屬原代肝細胞的分離。以下為詳細實驗流程：
1、實驗材料
1)動物：空白健康的6~8周雄性SD大鼠
2)儀器：恒溫水浴鍋、水平離心機、移液器、生物安全柜
3)試劑：膠原酶、灌流溶液A、灌流溶液B、消化終止液、分離液添加劑、肝細胞純化液
4)耗材：0.22um過濾器、20ml無菌注射器、10ml無菌注射器、5ml無菌注射器、無菌紗布、無菌剪刀、無菌鑷子、無菌燒杯、無菌擦手紙、無菌50mL離心管及巴氏吸管
2、試劑預處理
1)灌流溶液A：實驗前37℃水浴預熱30分鐘。
2)灌流溶液B：實驗前每100mL灌流溶液B中加入1支膠原酶，充分溶解后用0.22µm過濾器過濾。過濾后的溶液加入100uL分離液添加劑，然后37℃水浴預熱30分鐘。
3)消化終止液：實驗前在無菌條件下，每100mL消化終止液中加入100uL分離液添加劑，混勻后置于冰上備用。
3、實驗步驟及結果
(一) 肝臟獲取
1)盡可能于半分鐘內將大鼠斷頸處死后用75%酒精噴灑進行全身消毒，并轉移至生物安全柜中。
2)用鑷子將大鼠下腹部皮膚提起，并使用剪刀從下往上將大鼠腹部表皮剪開，以裸露腹部肌肉部位。
3)更換剪刀將大鼠肌肉部位剪開，使肝臟充分暴露，注意不要將大鼠內臟器官剪破。
(二) 組織處理
1)用剪刀剪開圖A所示位置，剪至能清晰可見每葉肝臟上都有較為明顯的靜脈孔，使用20mL注射器從靜脈孔處灌注灌流液A，將每葉肝臟都灌注至土黃色。
2)使用10mL注射器從靜脈孔處灌注灌流液B，直至肝臟軟爛。
(三) 細胞獲取
1)用鑷子將肝臟摘下置于含10mL灌流溶液B液的50mL離心管中并用剪刀將其充分剪碎至泥狀，補加灌流溶液B至30mL.
2)37℃水浴消化約3min,期間用巴氏吸管不斷攪拌。
3)消化結束后按照混懸液與消化終止液1：1的比例加入消化終止液。
4)無菌紗布過濾即得肝細胞懸液。
(四) 細胞洗滌
1)將肝細胞懸液輕輕顛倒混勻，分裝至50mL離心管。
2)70g（升速 3、降速 3）、4℃離心 5min。
3)在超凈工作臺中棄上清，消化終止液重懸細胞沉淀。
(五) 細胞純化
1)按照 7：3 的比例（即細胞懸液：肝細胞純化液）加入肝細胞純化液并混勻。
2)100g（升速 3、降速 3）、4℃離心 10min。
3)棄上清，使用凍存液將細胞重懸，并于液氮罐中保存。
如圖所示，該圖為IPHASE技術人員此次共分離得到的SD大鼠新鮮肝細胞照片，經0.4%臺盼藍染色后發現細胞活率在90%以上，且數量共有80million，說明以IPHASE原代肝細胞分離試劑盒為提取材料，可獲得純度高、活率好且數量多的新鮮原代肝細胞！
三、IPHASE相關產品
IPHASE作為體外研究生物試劑引領者，深刻識到原代肝細胞（Primary Hepatocytes）是構建體外肝臟模型的金標準，在藥物相互作用、藥物代謝和藥物毒性研究中受到研究者的廣泛青睞。因此，在兩步膠原酶灌注法的基礎上研發了原代肝細胞分離試劑盒，在標準的肝細胞分離流程（Hepatocyte Isolation Protocol）下進行肝細胞分離（Isolation of Primary Hepatocytes）和肝細胞提取，并以SD大鼠為實例，證明該試劑盒、該方法具有實用性！除此以外，IPHASE以相似分離流程，研發、生產了多種屬、多規格及多性別的懸浮或貼壁原代肝細胞，供客戶購買使用，為客戶縮短時間，節約成本！
IPHASE生產產品均具有以下優勢：
合規性：生產產品的組織均由正規渠道獲得，來源清晰。
安全性：生產組織均經過病原檢測，保證產品質量安全。
高質量：生產產品均經過嚴格的內部質控，且同批次數量多，批次間差異性小。
可定制：可根據客戶特殊需求，提供特殊種屬肝細胞的定制服務。
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匯智和源，致力于為創新藥研發企業及生命科學研究機構提供高品質的生物試劑，IPHASE為公司核心品牌，品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research”。
肝臟作為藥物暴露的主要器官，在藥物的代謝和毒性過程中起著至關重要的作用。原代肝細胞（Primary Hepatocytes）具有完整的細胞特性和生理水平的酶和輔助因子，既包括膜結合酶【如細胞色素P450（Cytochrome P450）混合功能氧化酶】，也包括胞質酯酶，擁有肝臟中所有的代謝途徑。因此，原代肝細胞（Primary Hepatocytes）被廣泛認為是構建體外肝臟模型的金標準，在藥物相互作用、藥物代謝和藥物毒性研究中受到研究者的青睞。
一、原代肝細胞分離方法
肝細胞分離（Isolation of Primary Hepatocytes）和肝細胞提取提取有直接剪切法、組織塊培養法、胰蛋白酶消化法、兩步膠原酶灌注法（Seglen灌注法）、半原位膠原酶灌注法等。
【直接剪切法】
原理：將肝臟切成小塊，然后用膠原酶或胰蛋白酶進行消化，分離得到肝細胞。
優點：操作簡單，適用于大量細胞的分離。
缺點：細胞損傷較大，純度較低。
【組織塊培養法】
原理：將肝臟切成小塊，在培養皿中加入含特定生長因子的培養液進行培養，使組織塊貼壁生長，然后逐漸分離得到肝細胞。
優點：能夠保持細胞的天然狀態，適用于長期培養。
缺點：操作較為繁瑣，細胞數量較少。
【胰蛋白酶消化法】
原理：用胰蛋白酶或胰酶對肝臟進行消化，分離得到肝細胞。
優點：能夠較為徹底地分解細胞間物質，獲得較純的肝細胞。
缺點：胰蛋白酶的價格較貴，成本較高。
【兩步膠原酶灌注法（Seglen灌注法）】
原理：用含有膠原酶的溶液通過門靜脈灌注到肝臟中，使肝實質細胞與間質分開，然后收集分離得到肝實質細胞。
優點：能夠保持細胞的天然狀態，適用于長期培養。
缺點：操作較為繁瑣，細胞數量較少。
【半原位膠原酶灌注法】
原理：將肝臟放置在特定裝置中，通過門靜脈灌注膠原酶溶液，使肝臟在生理狀態下進行消化，然后收集分離得到肝實質細胞。
優點：能夠較為真實地模擬生理狀態，獲得的細胞形態、活性較好。
缺點：操作較為復雜，成本較高。
其中，兩步膠原酶灌流法因其對肝細胞損傷作用較小，肝細胞產率和存活率高，成為了分離原代肝細胞的經典方法。
二、原代肝細胞分離流程
鑒于此，IPHASE作為體外研究生物試劑引領者，在兩步膠原酶灌注的基礎上，開發了原代肝細胞分離試劑盒，有標準的分離流程（Hepatocyte Isolation Protocol），其內整合了包括灌流液、膠原酶、細胞洗滌液、細胞純化液、試驗耗材等在內的所有組分，可適用于大鼠、小鼠等多個種屬原代肝細胞的分離。以下為詳細實驗流程：
1、實驗材料
1)動物：空白健康的6~8周雄性SD大鼠
2)儀器：恒溫水浴鍋、水平離心機、移液器、生物安全柜
3)試劑：膠原酶、灌流溶液A、灌流溶液B、消化終止液、分離液添加劑、肝細胞純化液
4)耗材：0.22um過濾器、20ml無菌注射器、10ml無菌注射器、5ml無菌注射器、無菌紗布、無菌剪刀、無菌鑷子、無菌燒杯、無菌擦手紙、無菌50mL離心管及巴氏吸管
2、試劑預處理
1)灌流溶液A：實驗前37℃水浴預熱30分鐘。
2)灌流溶液B：實驗前每100mL灌流溶液B中加入1支膠原酶，充分溶解后用0.22µm過濾器過濾。過濾后的溶液加入100uL分離液添加劑，然后37℃水浴預熱30分鐘。
3)消化終止液：實驗前在無菌條件下，每100mL消化終止液中加入100uL分離液添加劑，混勻后置于冰上備用。
3、實驗步驟及結果
(一) 肝臟獲取
1)盡可能于半分鐘內將大鼠斷頸處死后用75%酒精噴灑進行全身消毒，并轉移至生物安全柜中。
2)用鑷子將大鼠下腹部皮膚提起，并使用剪刀從下往上將大鼠腹部表皮剪開，以裸露腹部肌肉部位。
3)更換剪刀將大鼠肌肉部位剪開，使肝臟充分暴露，注意不要將大鼠內臟器官剪破。
(二) 組織處理
1)用剪刀剪開圖A所示位置，剪至能清晰可見每葉肝臟上都有較為明顯的靜脈孔，使用20mL注射器從靜脈孔處灌注灌流液A，將每葉肝臟都灌注至土黃色。
(三) 細胞獲取
1)用鑷子將肝臟摘下置于含10mL灌流溶液B液的50mL離心管中并用剪刀將其充分剪碎至泥狀，補加灌流溶液B至30mL.
2)37℃水浴消化約3min,期間用巴氏吸管不斷攪拌。
4)無菌紗布過濾即得肝細胞懸液。
(四) 細胞洗滌
1)將肝細胞懸液輕輕顛倒混勻，分裝至50mL離心管。
2)70g（升速 3、降速 3）、4℃離心 5min。
3)在超凈工作臺中棄上清，消化終止液重懸細胞沉淀。
(五) 細胞純化
1)按照 7：3 的比例（即細胞懸液：肝細胞純化液）加入肝細胞純化液并混勻。
2)100g（升速 3、降速 3）、4℃離心 10min。
3)棄上清，使用凍存液將細胞重懸，并于液氮罐中保存。
三、IPHASE相關產品
IPHASE作為體外研究生物試劑引領者，深刻識到原代肝細胞（Primary Hepatocytes）是構建體外肝臟模型的金標準，在藥物相互作用、藥物代謝和藥物毒性研究中受到研究者的廣泛青睞。因此，在兩步膠原酶灌注法的基礎上研發了原代肝細胞分離試劑盒，在標準的肝細胞分離流程（Hepatocyte Isolation Protocol）下進行肝細胞分離（Isolation of Primary Hepatocytes）和肝細胞提取，并以SD大鼠為實例，證明該試劑盒、該方法具有實用性！除此以外，IPHASE以相似分離流程，研發、生產了多種屬、多規格及多性別的懸浮或貼壁原代肝細胞，供客戶購買使用，為客戶縮短時間，節約成本！
| 產品 | 種屬 | 規格 |
| 原代肝細胞分離試劑盒 | 多種屬 | 1套 |
| 新鮮/凍存懸浮肝細胞 | 人/猴/犬/大鼠/小鼠/貓/豬/兔/雞/金黃地鼠 | 2/5 miliion |
| 新鮮/凍存貼壁肝細胞 | 人/猴/犬/大鼠/小鼠/貓/豬/兔 | 2/5 miliion |
| 培養基 | 復蘇/鋪板/維持/代謝 | 10/20/50 mL |
| 膠原包被板 | 6/12/24/48/96孔 | 1/5塊 |
| 超低吸附培養板平底 | 6/12/24/48/96孔 | 1/5 個 |
| 超低吸附培養板U底 | 96孔 | 1/5 個 |
IPHASE生產產品均具有以下優勢：
合規性：生產產品的組織均由正規渠道獲得，來源清晰。
安全性：生產組織均經過病原檢測，保證產品質量安全。
高質量：生產產品均經過嚴格的內部質控，且同批次數量多，批次間差異性小。
可定制：可根據客戶特殊需求，提供特殊種屬肝細胞的定制服務。
關 于 我 們
匯智和源，致力于為創新藥研發企業及生命科學研究機構提供高品質的生物試劑，IPHASE為公司核心品牌，品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research”。
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