實(shí)驗(yàn)室PCR反應(yīng)的污染的應(yīng)對處理方法
PCR技術(shù)是一種體外模擬DNA復(fù)制過程的核酸擴(kuò)增技術(shù)，主要通過重復(fù)高溫變性、低溫退火和延伸三個(gè)循環(huán)，然后將靶DNA擴(kuò)增數(shù)百萬倍，因此PCR技術(shù)的優(yōu)勢就是極高的靈敏度，但是任何事物都有其兩面性，PCR技術(shù)最大的一個(gè)缺點(diǎn)就是—易污染，極其微量的污染都有可能導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生。一旦發(fā)生實(shí)驗(yàn)室核酸污染，正常開展的實(shí)驗(yàn)就必須要停止，然后花費(fèi)大量物力、人力直到尋找污染源，或者實(shí)驗(yàn)室清潔達(dá)標(biāo)為止，而且實(shí)驗(yàn)報(bào)告結(jié)果必須作廢，需重新實(shí)驗(yàn)，結(jié)果才可靠。為了有效的避免污染，獲得穩(wěn)定可靠的檢驗(yàn)結(jié)果，我們在實(shí)際的工作當(dāng)中往往需要采用一定的措施來預(yù)防或者消除污染。
一、污染的來源：
1、試劑污染
由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣器、容器、水及其他溶液被核酸污染。
2、設(shè)備污染
半自動核酸提取儀、全自動核酸提取儀在提取過程導(dǎo)致濺灑樣本或者核酸模板，污染機(jī)器。或者設(shè)備內(nèi)垃圾筒清潔不徹底，殘留液體或結(jié)晶揮發(fā)形成氣溶膠對造成污染。
3、標(biāo)本交叉污染
可能是由于收集標(biāo)本的容器被污染，標(biāo)本放置時(shí)由于密封不嚴(yán)溢于容器外，容器外黏有標(biāo)本，吸樣器污染及空氣中的氣溶膠導(dǎo)致的標(biāo)本間交叉污染。尤其是病毒類可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散，導(dǎo)致彼此間的污染。
4、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染
這是PCR中最常見的污染問題，常見于需要在擴(kuò)增后開蓋的檢測項(xiàng)目，或者是擴(kuò)增后產(chǎn)物處理不當(dāng)，因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量大，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測數(shù)個(gè)拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染就可形成假陽性。
5、克隆質(zhì)粒的污染
在實(shí)驗(yàn)室操作中經(jīng)常會用到陽性參考品，這些陽性參考品大多數(shù)是由某些用克隆質(zhì)粒制作而成，克隆質(zhì)粒在單位容積內(nèi)濃度高，不小心使用極易造成污染。
有些實(shí)驗(yàn)室自己克隆質(zhì)粒做質(zhì)控品，配制過程后，垃圾的處理方式不嚴(yán)格等，從而造成質(zhì)控品對實(shí)驗(yàn)室的污染進(jìn)而造成實(shí)驗(yàn)室對標(biāo)本的污染。
二、控制污染的措施：
1、實(shí)驗(yàn)分區(qū)域
合理分隔實(shí)驗(yàn)室。將樣品的處理、配制PCR反應(yīng)液、PCR循環(huán)擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進(jìn)行，特別注意標(biāo)本處理及PCR產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其他步驟嚴(yán)格分開。
最好能劃分：標(biāo)本處理區(qū)，PCR反應(yīng)液制備區(qū)，PCR循環(huán)擴(kuò)增區(qū)，PCR產(chǎn)物鑒定區(qū)。其實(shí)驗(yàn)用品及吸樣槍應(yīng)專用。
實(shí)驗(yàn)前應(yīng)將實(shí)驗(yàn)室用紫外線消毒以破壞殘留的 DNA 或RNA.
2、各區(qū)物品不得混用
各個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域要對不同設(shè)備、物品顏色有明顯的標(biāo)記，如各區(qū)域使用專門的工作服、工作鞋、垃圾桶、拖把、抹布、筆等，避免不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品混用。
使用一次性用具吸頭、離心管、無粉塵手套、口罩等
3、設(shè)置規(guī)范的空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)
盡可能采用全送全排空調(diào)系統(tǒng)。在進(jìn)入各個(gè)操作區(qū)域需要嚴(yán)格單一向進(jìn)行，即試劑準(zhǔn)備和貯存區(qū)→樣品制備區(qū)→ＰＣＲ擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)，不得逆行。
4、污染監(jiān)測
設(shè)立陽性對照、陰性對照，進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，選擇不相同區(qū)域的引物進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增等，做好污染監(jiān)測，以便采取措施防止和消除污染。
5、定期實(shí)驗(yàn)室清潔
配制含有效氯 0.5% 的消毒液對設(shè)備表面、臺面、地面、物品表面、傳遞窗內(nèi)及門窗進(jìn)行擦拭，對設(shè)備內(nèi)垃圾桶進(jìn)行浸泡。
根據(jù)從上到下、從里到外的原則進(jìn)行酒精對空噴灑。
酒精擦拭（75%）移液器、八連管離心機(jī)、混勻振蕩器等小型設(shè)備。
純化水對設(shè)備表面、臺面、地面進(jìn)行擦拭，對設(shè)備垃圾桶進(jìn)行沖洗。
一、污染的來源：
1、試劑污染
由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣器、容器、水及其他溶液被核酸污染。
2、設(shè)備污染
半自動核酸提取儀、全自動核酸提取儀在提取過程導(dǎo)致濺灑樣本或者核酸模板，污染機(jī)器。或者設(shè)備內(nèi)垃圾筒清潔不徹底，殘留液體或結(jié)晶揮發(fā)形成氣溶膠對造成污染。
3、標(biāo)本交叉污染
可能是由于收集標(biāo)本的容器被污染，標(biāo)本放置時(shí)由于密封不嚴(yán)溢于容器外，容器外黏有標(biāo)本，吸樣器污染及空氣中的氣溶膠導(dǎo)致的標(biāo)本間交叉污染。尤其是病毒類可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散，導(dǎo)致彼此間的污染。
4、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染
這是PCR中最常見的污染問題，常見于需要在擴(kuò)增后開蓋的檢測項(xiàng)目，或者是擴(kuò)增后產(chǎn)物處理不當(dāng)，因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量大，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測數(shù)個(gè)拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染就可形成假陽性。
5、克隆質(zhì)粒的污染
在實(shí)驗(yàn)室操作中經(jīng)常會用到陽性參考品，這些陽性參考品大多數(shù)是由某些用克隆質(zhì)粒制作而成，克隆質(zhì)粒在單位容積內(nèi)濃度高，不小心使用極易造成污染。
有些實(shí)驗(yàn)室自己克隆質(zhì)粒做質(zhì)控品，配制過程后，垃圾的處理方式不嚴(yán)格等，從而造成質(zhì)控品對實(shí)驗(yàn)室的污染進(jìn)而造成實(shí)驗(yàn)室對標(biāo)本的污染。
二、控制污染的措施：
1、實(shí)驗(yàn)分區(qū)域
合理分隔實(shí)驗(yàn)室。將樣品的處理、配制PCR反應(yīng)液、PCR循環(huán)擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進(jìn)行，特別注意標(biāo)本處理及PCR產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其他步驟嚴(yán)格分開。
最好能劃分：標(biāo)本處理區(qū)，PCR反應(yīng)液制備區(qū)，PCR循環(huán)擴(kuò)增區(qū)，PCR產(chǎn)物鑒定區(qū)。其實(shí)驗(yàn)用品及吸樣槍應(yīng)專用。
實(shí)驗(yàn)前應(yīng)將實(shí)驗(yàn)室用紫外線消毒以破壞殘留的 DNA 或RNA.
2、各區(qū)物品不得混用
各個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域要對不同設(shè)備、物品顏色有明顯的標(biāo)記，如各區(qū)域使用專門的工作服、工作鞋、垃圾桶、拖把、抹布、筆等，避免不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品混用。
使用一次性用具吸頭、離心管、無粉塵手套、口罩等
3、設(shè)置規(guī)范的空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)
盡可能采用全送全排空調(diào)系統(tǒng)。在進(jìn)入各個(gè)操作區(qū)域需要嚴(yán)格單一向進(jìn)行，即試劑準(zhǔn)備和貯存區(qū)→樣品制備區(qū)→ＰＣＲ擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)，不得逆行。
4、污染監(jiān)測
設(shè)立陽性對照、陰性對照，進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，選擇不相同區(qū)域的引物進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增等，做好污染監(jiān)測，以便采取措施防止和消除污染。
5、定期實(shí)驗(yàn)室清潔
配制含有效氯 0.5% 的消毒液對設(shè)備表面、臺面、地面、物品表面、傳遞窗內(nèi)及門窗進(jìn)行擦拭，對設(shè)備內(nèi)垃圾桶進(jìn)行浸泡。
根據(jù)從上到下、從里到外的原則進(jìn)行酒精對空噴灑。
酒精擦拭（75%）移液器、八連管離心機(jī)、混勻振蕩器等小型設(shè)備。
純化水對設(shè)備表面、臺面、地面進(jìn)行擦拭，對設(shè)備垃圾桶進(jìn)行沖洗。
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