在生命科學(xué)領(lǐng)域，從細(xì)胞的精細(xì)結(jié)構(gòu)到組織的動(dòng)態(tài)變化，成像技術(shù)的進(jìn)步始終推動(dòng)著生物學(xué)研究的邊界。雙光子光片顯微鏡作為一項(xiàng)前沿技術(shù)，以其高分辨率、低光毒性和深層成像能力，在腦神經(jīng)活動(dòng)監(jiān)測(cè)、胚胎發(fā)育追蹤等研究中展現(xiàn)出巨大潛力。然而，傳統(tǒng)技術(shù)中光片厚度與長度的矛盾始終限制著其應(yīng)用范圍。本文將聚焦于貝塞爾雙光子光片顯微鏡的創(chuàng)新突破，解析其如何通過液晶空間光調(diào)制器實(shí)現(xiàn)"無衍射"光束整形，突破傳統(tǒng)成像瓶頸，為活體生物成像開辟全新視野。

研究背景與技術(shù)挑戰(zhàn)
雙光子光片顯微鏡的優(yōu)勢(shì)與局限
雙光子光片顯微鏡融合了雙光子激發(fā)的非線性光學(xué)效應(yīng)與光片照明的層切特性，成為活體成像領(lǐng)域的明星技術(shù)。其工作原理基于照明光路與成像光路的正交設(shè)計(jì)，僅焦平面處的熒光分子被激發(fā)，這種選擇性照明顯著降低了非焦平面的光毒性與光漂白效應(yīng)。同時(shí)，雙光子激發(fā)概率與光強(qiáng)平方成正比，使得激發(fā)區(qū)域高度局域化，進(jìn)一步提升了軸向分辨率。然而，傳統(tǒng)高斯光束在軸向方向的快速衍射展寬，導(dǎo)致光片長度與厚度難以兼顧——薄光片雖能提高軸向分辨率，但受限于短光片長度，成像視場被極大壓縮；而擴(kuò)展光片長度則必然犧牲厚度，降低層切效果。這種固有矛盾如同一道技術(shù)天花板，限制了該技術(shù)在大視場高分辨率成像中的應(yīng)用潛力。

國內(nèi)外技術(shù)演進(jìn)與瓶頸
為突破這一局限，國際研究團(tuán)隊(duì)曾嘗試多種方案。2015年北京大學(xué)陳良怡團(tuán)隊(duì)利用TAG透鏡實(shí)現(xiàn)焦點(diǎn)快速掃描，雖在170μm視場內(nèi)取得420nm橫向分辨率，但受限于進(jìn)口管制，該方案難以在國內(nèi)推廣。2020年UTSouthwestern團(tuán)隊(duì)通過引入額外振鏡系統(tǒng)擴(kuò)展光片長度，卻因光路復(fù)雜性與視場局限性，未能實(shí)現(xiàn)真正意義的突破。這些嘗試雖在局部參數(shù)上取得進(jìn)展，但均未能從根本上解決光片厚度與長度的矛盾，行業(yè)內(nèi)亟需一種既能保持光片超薄特性，又能實(shí)現(xiàn)長距離無衍射傳播的創(chuàng)新方案。

技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用
貝塞爾光束的"無衍射"特性與調(diào)制原理
貝塞爾光束作為數(shù)學(xué)與物理結(jié)合的奇跡，其核心特性在于傳播過程中光強(qiáng)分布保持不變的"無衍射"特性。這種光束由多個(gè)平面波相干疊加形成，中心主光瓣周圍環(huán)繞著強(qiáng)度遞減的旁瓣。在雙光子激發(fā)模式下，由于旁瓣強(qiáng)度遠(yuǎn)低于主光瓣，僅有中心光束能有效激發(fā)熒光，形成理想的"針狀"光片，完美解決了傳統(tǒng)高斯光束的固有缺陷。

光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計(jì)與工程實(shí)現(xiàn)
研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建的貝塞爾雙光子光片顯微鏡采用近紅外飛秒激光作為光源，通過擴(kuò)束器、液晶空間光調(diào)制器及4F透鏡系統(tǒng)，將調(diào)制后的貝塞爾光束精準(zhǔn)投射至樣品平面。照明光路與成像光路的正交設(shè)計(jì)確保了層切效果，而低通濾光片有效屏蔽散射光干擾。該系統(tǒng)創(chuàng)造性地將貝塞爾光束的理論優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)化為工程實(shí)踐，實(shí)現(xiàn)了310μm×1.9μm的光片參數(shù)，長度厚度比達(dá)到驚人的163:1，突破性地將成像視場擴(kuò)展至傳統(tǒng)技術(shù)的十倍以上，同時(shí)保持亞微米級(jí)軸向分辨率。

活體成像的臨床轉(zhuǎn)化潛力
這項(xiàng)技術(shù)的臨床應(yīng)用前景令人矚目。在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域，其大視場高分辨率特性可實(shí)現(xiàn)腦神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)；在發(fā)育生物學(xué)中，能夠追蹤胚胎器官形成過程中的細(xì)胞遷移軌跡；對(duì)于腫瘤研究，可實(shí)時(shí)觀察血管生成與腫瘤侵襲邊界。特別值得注意的是，該技術(shù)的低光毒性特性使其適用于長時(shí)間活體觀察，為研究細(xì)胞行為學(xué)提供了前所未有的工具。與傳統(tǒng)技術(shù)相比，貝塞爾光片顯微鏡不僅提升了成像性能，更拓展了應(yīng)用場景的邊界，有望成為生物醫(yī)學(xué)研究的標(biāo)準(zhǔn)化平臺(tái)。

成像實(shí)驗(yàn)與結(jié)果分析
熒光微珠分辨率驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)
研究團(tuán)隊(duì)采用直徑100nm的熒光微珠進(jìn)行分辨率標(biāo)定實(shí)驗(yàn)。在瓊脂柱中均勻分布的微珠呈現(xiàn)出規(guī)則的點(diǎn)陣結(jié)構(gòu)，成像結(jié)果表明整個(gè)視場內(nèi)微珠亮度均勻、形態(tài)清晰。通過對(duì)X、Y方向灰度分布的高斯擬合分析，測(cè)得橫向分辨率為440nm，接近理論衍射極限。Z軸方向的層切實(shí)驗(yàn)顯示軸向分辨率為1.88μm，與設(shè)計(jì)參數(shù)高度吻合。這種三維各向異性分辨率的精確匹配，驗(yàn)證了貝塞爾光束在保持大視場的同時(shí)，能夠維持納米級(jí)橫向分辨率與亞微米級(jí)軸向分辨率的卓越性能。

活體斑馬魚胚胎成像驗(yàn)證
以吖啶橙染色的5天齡斑馬魚胚胎為模型，實(shí)驗(yàn)成功捕捉到血液細(xì)胞的動(dòng)態(tài)流動(dòng)過程。通過對(duì)200幀連續(xù)圖像的追蹤分析，測(cè)得血液流速為22.6μm/s，驗(yàn)證了系統(tǒng)的時(shí)序分辨率。更令人振奮的是，貝塞爾光束能夠穿透胚胎脊柱，清晰分辨骨細(xì)胞形態(tài)并實(shí)現(xiàn)自動(dòng)分割計(jì)數(shù)。這種穿透性成像能力突破了組織散射極限，為深層組織的無損觀測(cè)提供了可能。與傳統(tǒng)技術(shù)相比，該系統(tǒng)在保持高分辨率的同時(shí)，將成像深度提升了2-3倍，為活體胚胎發(fā)育研究提供了全新視角。

總結(jié)與展望
貝塞爾雙光子光片顯微鏡通過液晶空間光調(diào)制器的精密相位調(diào)控，將貝塞爾光束的無衍射特性應(yīng)用于雙光子激發(fā)，突破了傳統(tǒng)高斯光束在光片長度與厚度上的固有矛盾。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證表明，該技術(shù)在310μm視場范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)了440nm橫向分辨率和1.9μm軸向分辨率，成功解決了長期困擾領(lǐng)域的技術(shù)瓶頸。熒光微珠實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其納米級(jí)分辨率，活體斑馬魚胚胎成像展示了其在深層組織穿透和動(dòng)態(tài)觀測(cè)中的卓越性能。

未來，該技術(shù)的發(fā)展將聚焦于軸向分辨率的進(jìn)一步提升和多模態(tài)成像融合。通過優(yōu)化旁瓣抑制技術(shù)，有望實(shí)現(xiàn)各向同性的三維分辨率；結(jié)合光聲成像或超聲層析技術(shù)，可構(gòu)建多維度信息獲取平臺(tái)。在臨床轉(zhuǎn)化方面，該技術(shù)有望應(yīng)用于實(shí)時(shí)術(shù)中導(dǎo)航、腫瘤微環(huán)境監(jiān)測(cè)及神經(jīng)退行性疾病研究等領(lǐng)域。貝塞爾雙光子光片顯微鏡不僅為生命科學(xué)研究提供了革命性工具，更可能催生全新研究范式。

DOI:10.37188/CJLCD. 2024-0303.