在蛋白功能研究中，親和力測定是揭示分子互作機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。然而，傳統(tǒng)方法通常依賴高純度蛋白，而許多蛋白如膜蛋白、低溶解度蛋白等的研究就受到了限制。微量熱泳動技術(shù) (MST) 以其高靈敏度、低樣本需求和對粗樣品的兼容性，不僅可以檢測重組蛋白，還為難純化蛋白的親和力測定提供了突破性的解決方案。

Section.01
微量熱泳動 (MST)

微量熱泳動（Microscale Thermophoresis, MST）是一種通過監(jiān)測溫度梯度場中生物分子的遷移行為來研究分子互作的技術(shù)。該技術(shù)利用熒光標(biāo)記，精確捕捉分子在熱泳動效應(yīng)下的運動變化，從而實現(xiàn)對結(jié)合親和力的高靈敏度定量分析。

MST 技術(shù)通過紅外激光在樣品溶液中建立局部溫度場實現(xiàn)分子相互作用分析。實驗時，將一個分子（如蛋白）用熒光染料標(biāo)記或融合 GFP 標(biāo)簽，與待測分子按濃度梯度置于毛細(xì)管中。當(dāng)激光聚焦加熱時，會在照射區(qū)域形成溫度梯度分布，分子由高溫區(qū)域向低溫區(qū)域定向遷移，其遷移的程度與質(zhì)量、帶電性及分子間相互作用密切相關(guān)，通過檢測熒光標(biāo)記的分子或天然熒光分子的熒光信號，可以獲得分子間結(jié)合的親和力常數(shù) Kd。

圖 1. MST 技術(shù)示意圖。

Section.02
方案一: 直接檢測重組蛋白

實驗流程

 
案例一

2024 年，研究人員在 Cell 上發(fā)表了題為 "A gut-derived hormone regulates cholesterol metabolism" 的研究論文，揭示了 Cholesin（腸抑脂素）通過與 GPR146 蛋白結(jié)合，可抑制肝臟中的 PKA-ERK1/2 信號傳導(dǎo)，從而控制膽固醇的合成，最終降低循環(huán)膽固醇水平^[1]。

圖 2. MST 檢測 Cholesin 和 GPR146 (WT or Mut) 蛋白的親和力^[1]。

本研究中，作者使用 MST 技術(shù)定量測定了 Cholesin 與 GPR146（WT）蛋白的親和力，測得平衡解離常數(shù) Kd 值為 21.34 ± 0.98 nM，表明兩者具有很高的親和力。

為了確定關(guān)鍵結(jié)合位點，作者基于 AlphaFold 預(yù)測的 GPR146 蛋白結(jié)構(gòu)，構(gòu)建了多個突變體，并通過 MST 檢測 GPR146（Mut）蛋白與 Cholesin 的親和力。結(jié)果顯示，突變體蛋白測定的 Kd 值顯著降低，為 971.0 ± 91.5 nM，證實了突變氨基酸對二者結(jié)合的重要性，為膽固醇代謝調(diào)控機(jī)制提供了分子層面的證據(jù)。

Section.03
方案二: 使用細(xì)胞裂解液檢測

實驗流程

 
案例一

2024 年，研究人員在 Nature 上發(fā)表了題為 "Glutamate acts on acid-sensing ion channels to worsen ischaemic brain injury" 的研究論文，揭示了谷氨酸不僅通過 N-甲基-D-天冬氨酸受體 (NMDAR) 激活細(xì)胞死亡通路，還可通過增強(qiáng)酸敏感離子通道(ASICs) 的電流，加劇缺血性腦損傷，為開發(fā)更有效的中風(fēng)治療藥物提供了新的靶點^[2]。

圖 3. 不同 pH 條件下，谷氨酸和 ASIC1a 的 MST 檢測結(jié)果^[2]。

作者構(gòu)建了 ASIC1a（酸敏感離子通道 1a 亞型）與 GFP（綠色熒光蛋白）的融合質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)染至 HEK293T 細(xì)胞中。隨后，細(xì)胞被裂解，離心后取上清液，直接使用細(xì)胞裂解液進(jìn)行 MST 實驗。實驗證明，在 pH 6.8 和 pH 7.0 的條件下，谷氨酸與 hASIC1a-GFP 結(jié)合，測得的親和力（Kd）分別為 113.3 μM 和 392.5 μM，表明谷氨酸在較低的 pH 下結(jié)合更強(qiáng)。

案例二

2023 年，研究人員在 Cell Chem Biol 上發(fā)表了題為 "Ainsliadimer A induces ROS-mediated apoptosis in colorectal cancer cells via directly targeting peroxiredoxin 1 and 2" 的研究論文，報道了一種具有抗腫瘤活性的倍半萜內(nèi)酯二聚體 ainsliadimer A (AIN)，其通過直接靶向 PRDX1 和 PRDX2 蛋白，抑制它們的過氧化物酶活性，進(jìn)而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡，同時抑制小鼠腫瘤生長和腫瘤類器官模型生長^[3]。

圖 4. AIN 與 PRDX1、PRDX2 重組蛋白的 MST 檢測結(jié)果^[3]。

作者首先通過 MST 檢測發(fā)現(xiàn)，AIN 與重組蛋白 PRDX1 和 PRDX2 均能結(jié)合，Kd 值分別為 1.66 μM 和 9.35 μM。隨后，為了確定 AIN 分別與 2 個蛋白的結(jié)合位點，作者利用細(xì)胞裂解液檢測了野生型與突變型 PRDX1/2-GFP 與 AIN 的結(jié)合。結(jié)果表明，PRDX1 的 Cys173 和 PRDX2 的 Cys172 是 AIN 的關(guān)鍵結(jié)合位點，突變這兩個位點后，AIN與 PRDX1 和 PRDX2 蛋白均不結(jié)合。

圖 5. AIN 與 PRDX1-GFP、PRDX2-GFP 的 MST 檢測結(jié)果^[3]。

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[1] Hu X.L, et al. A gut-derived hormone regulates cholesterol metabolism. Cell. 2024 Mar 28;187(7):1685-1700.e18.
[2] Lai K, et al. Glutamate acts on acid-sensing ion channels to worsen ischaemic brain injury. Nature. 2024 Jul;631(8022):826-834.
[3] Lv C, et al. Ainsliadimer A induces ROS-mediated apoptosis in colorectal cancer cells via directly targeting peroxiredoxin 1 and 2. Cell Chem Biol. 2023 Mar 16;30(3):295-307.e5.