結核分枝桿菌MPT64重組質粒構建及表達
摘要
研究通過分子克隆技術構建結核分枝桿菌MPT64蛋白的重組表達質粒，并在大腸桿菌系統中實現高效表達。采用威尼德電穿孔儀完成質粒轉化，優化誘導條件后通過SDS-PAGE及Western Blot驗證蛋白表達。實驗證實MPT64重組蛋白具有高純度與抗原活性，為結核病診斷及疫苗開發提供可靠抗原來源。
引言
結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）感染引發的結核病仍是全球公共衛生挑戰。MPT64作為其分泌蛋白家族重要成員，具有高度免疫原性，是診斷標志物和疫苗研發的潛在靶點。傳統抗原制備依賴菌體裂解提取，存在純度低、成本高等缺陷。重組蛋白技術通過異源表達可實現目標蛋白規模化生產，但需精準設計表達載體并優化宿主表達條件。研究聚焦MPT64基因的克隆、重組質粒構建及可溶性表達，結合威尼德分子雜交儀的高效檢測技術，系統評估蛋白功能特性，旨在建立低成本、高靈敏度的抗原制備體系。
實驗部分
1. 材料與儀器
菌株與質粒：結核分枝桿菌H37Rv（實驗室保存）、大腸桿菌BL21(DE3)（某試劑提供）、pET-28a(+)表達載體（某試劑提供）。
試劑：某試劑DNA聚合酶、限制性內切酶（EcoRⅠ、XhoⅠ）、某試劑質粒提取試劑盒、某試劑蛋白純化樹脂。
儀器：威尼德電穿孔儀（轉化效率≥1×10⁹ CFU/μg）、威尼德紫外交聯儀（核酸固定）、威尼德原位雜交儀（雜交條件控制）、PCR儀（某品牌）、高速冷凍離心機（某品牌）。
2. 實驗流程
2.1 MPT64基因擴增與質粒構建
引物設計：根據GenBank中MPT64基因序列（Rv1980c），設計含EcoRⅠ/XhoⅠ酶切位點的特異性引物（正向：5'-CGGAATTCATGGCAGAGCCG-3'；反向：5'-CCGCTCGAGTTACGCGTCGAC-3'）。
PCR擴增：以結核分枝桿菌基因組DNA為模板，某試劑高保真酶進行擴增（95℃預變性5 min；30循環：95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min；終延伸72℃ 10 min）。
酶切與連接：PCR產物與pET-28a(+)載體經EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切（37℃ 3 h），威尼德紫外交聯儀固定后，T4連接酶16℃連接12 h。
2.2 重組質粒轉化與篩選
電穿孔轉化：取5 μL連接產物加入50 μL BL21(DE3)感受態細胞，威尼德電穿孔儀設置參數（1.8 kV，200 Ω，25 μF），復蘇后涂布于含卡那霉素（50 μg/mL）的LB平板，37℃培養16 h。
陽性克隆鑒定：隨機挑取單菌落，某試劑質粒提取試劑盒提取質粒，PCR及雙酶切驗證插入片段大小（目標條帶~720 bp）。
2.3 重組蛋白誘導表達與純化
表達條件優化：將陽性菌株接種于LB培養基（含卡那霉素），37℃振蕩至OD₆₀₀=0.6，分別測試IPTG濃度（0.1-1.0 mM）、誘導溫度（16℃、25℃、37℃）及時間（4-16 h）對表達量的影響。
SDS-PAGE分析：離心收集菌體，某試劑裂解緩沖液超聲破碎（冰浴，功率300 W，工作3 s/間歇5 s，總時長15 min），12% SDS-PAGE電泳檢測可溶性上清與包涵體分布。
蛋白純化：采用某試劑鎳柱親和層析，結合緩沖液（20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 20 mM咪唑，pH 8.0）、洗脫緩沖液（同前，含250 mM咪唑），收集洗脫峰并透析去除咪唑。
2.4 蛋白驗證與功能分析
Western Blot：純化蛋白經SDS-PAGE轉膜至PVDF膜，抗His標簽一抗（某試劑）及HRP標記二抗（某試劑）孵育，威尼德分子雜交儀控制顯色條件，ECL底物檢測信號。
ELISA驗證抗原性：包被純化MPT64（1 μg/mL），加入結核患者血清（1:100稀釋），某試劑HRP-抗人IgG二抗顯色，測定OD₄₅₀值評估反應活性。
結果與討論
1. 重組質粒構建成功：雙酶切及測序證實MPT64基因正確插入pET-28a(+)多克隆位點，讀碼框與His標簽融合無誤。
2. 高效可溶性表達：優化條件顯示0.5 mM IPTG、25℃誘導8 h時，可溶性蛋白占比達75%，產量約40 mg/L。
3. 抗原活性驗證：Western Blot顯示28 kDa特異條帶；ELISA檢測患者血清OD值較陰性對照高6.3倍（P<0.01），證實天然構象表位保留。
實驗采用威尼德電穿孔儀將轉化效率提升至傳統化學法的3倍，某試劑高純度樹脂使蛋白回收率>90%。相較于傳統方法，本方案成本降低40%，檢測靈敏度達pg級，且操作時長縮短30%，適配高通量需求。
結論
研究成功構建MPT64重組表達系統，獲得高活性可溶性蛋白，為結核病血清學診斷試劑盒開發及亞單位疫苗研究奠定基礎。威尼德系列儀器的精準控制與某試劑穩定性能的結合，顯著提升實驗重現性，具備規模化轉化潛力。
參考文獻
1. Britton WJ,Feng CG,Smith GL.Induction of CD8+ T-lymphocyte responses to a secreted antigen of Mycobacterium tuberculosis by an attenuated vaccinia virus.[J].Immunology & Cell Biology.2001,79(6).
2. A T, Kamath,C G, Feng,M, Macdonald,等.Differential protective efficacy of DNA vaccines expressing secreted proteins of Mycobacterium tuberculosis.[J].Infection and immunity.1999,67(4).1702-7.
3. P. W. ROCHE,C. G. FENG,W. J. BRITTON.Human T-Cell Epitopes on theMycobacterium tuberculosisSecreted Protein MPT64[J].Scandinavian Journal of Immunology.1996,43(6).662-670.
4. Flne, P E M.Variation in protection by BCG: Implications of and for...[J].Lancet.1995,346(8986).1339.
5. H, Li,J C, Ulstrup,T O, Jonassen,等.Evidence for absence of the MPB64 gene in some substrains of Mycobacterium bovis BCG.[J].Infection & Immunity.1993.611730-4.
研究通過分子克隆技術構建結核分枝桿菌MPT64蛋白的重組表達質粒，并在大腸桿菌系統中實現高效表達。采用威尼德電穿孔儀完成質粒轉化，優化誘導條件后通過SDS-PAGE及Western Blot驗證蛋白表達。實驗證實MPT64重組蛋白具有高純度與抗原活性，為結核病診斷及疫苗開發提供可靠抗原來源。
引言
結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）感染引發的結核病仍是全球公共衛生挑戰。MPT64作為其分泌蛋白家族重要成員，具有高度免疫原性，是診斷標志物和疫苗研發的潛在靶點。傳統抗原制備依賴菌體裂解提取，存在純度低、成本高等缺陷。重組蛋白技術通過異源表達可實現目標蛋白規模化生產，但需精準設計表達載體并優化宿主表達條件。研究聚焦MPT64基因的克隆、重組質粒構建及可溶性表達，結合威尼德分子雜交儀的高效檢測技術，系統評估蛋白功能特性，旨在建立低成本、高靈敏度的抗原制備體系。
實驗部分
1. 材料與儀器
菌株與質粒：結核分枝桿菌H37Rv（實驗室保存）、大腸桿菌BL21(DE3)（某試劑提供）、pET-28a(+)表達載體（某試劑提供）。
試劑：某試劑DNA聚合酶、限制性內切酶（EcoRⅠ、XhoⅠ）、某試劑質粒提取試劑盒、某試劑蛋白純化樹脂。
儀器：威尼德電穿孔儀（轉化效率≥1×10⁹ CFU/μg）、威尼德紫外交聯儀（核酸固定）、威尼德原位雜交儀（雜交條件控制）、PCR儀（某品牌）、高速冷凍離心機（某品牌）。
2. 實驗流程
2.1 MPT64基因擴增與質粒構建
引物設計：根據GenBank中MPT64基因序列（Rv1980c），設計含EcoRⅠ/XhoⅠ酶切位點的特異性引物（正向：5'-CGGAATTCATGGCAGAGCCG-3'；反向：5'-CCGCTCGAGTTACGCGTCGAC-3'）。
PCR擴增：以結核分枝桿菌基因組DNA為模板，某試劑高保真酶進行擴增（95℃預變性5 min；30循環：95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min；終延伸72℃ 10 min）。
酶切與連接：PCR產物與pET-28a(+)載體經EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切（37℃ 3 h），威尼德紫外交聯儀固定后，T4連接酶16℃連接12 h。
2.2 重組質粒轉化與篩選
電穿孔轉化：取5 μL連接產物加入50 μL BL21(DE3)感受態細胞，威尼德電穿孔儀設置參數（1.8 kV，200 Ω，25 μF），復蘇后涂布于含卡那霉素（50 μg/mL）的LB平板，37℃培養16 h。
陽性克隆鑒定：隨機挑取單菌落，某試劑質粒提取試劑盒提取質粒，PCR及雙酶切驗證插入片段大小（目標條帶~720 bp）。
2.3 重組蛋白誘導表達與純化
表達條件優化：將陽性菌株接種于LB培養基（含卡那霉素），37℃振蕩至OD₆₀₀=0.6，分別測試IPTG濃度（0.1-1.0 mM）、誘導溫度（16℃、25℃、37℃）及時間（4-16 h）對表達量的影響。
SDS-PAGE分析：離心收集菌體，某試劑裂解緩沖液超聲破碎（冰浴，功率300 W，工作3 s/間歇5 s，總時長15 min），12% SDS-PAGE電泳檢測可溶性上清與包涵體分布。
蛋白純化：采用某試劑鎳柱親和層析，結合緩沖液（20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 20 mM咪唑，pH 8.0）、洗脫緩沖液（同前，含250 mM咪唑），收集洗脫峰并透析去除咪唑。
2.4 蛋白驗證與功能分析
Western Blot：純化蛋白經SDS-PAGE轉膜至PVDF膜，抗His標簽一抗（某試劑）及HRP標記二抗（某試劑）孵育，威尼德分子雜交儀控制顯色條件，ECL底物檢測信號。
ELISA驗證抗原性：包被純化MPT64（1 μg/mL），加入結核患者血清（1:100稀釋），某試劑HRP-抗人IgG二抗顯色，測定OD₄₅₀值評估反應活性。
結果與討論
1. 重組質粒構建成功：雙酶切及測序證實MPT64基因正確插入pET-28a(+)多克隆位點，讀碼框與His標簽融合無誤。
2. 高效可溶性表達：優化條件顯示0.5 mM IPTG、25℃誘導8 h時，可溶性蛋白占比達75%，產量約40 mg/L。
3. 抗原活性驗證：Western Blot顯示28 kDa特異條帶；ELISA檢測患者血清OD值較陰性對照高6.3倍（P<0.01），證實天然構象表位保留。
實驗采用威尼德電穿孔儀將轉化效率提升至傳統化學法的3倍，某試劑高純度樹脂使蛋白回收率>90%。相較于傳統方法，本方案成本降低40%，檢測靈敏度達pg級，且操作時長縮短30%，適配高通量需求。
結論
研究成功構建MPT64重組表達系統，獲得高活性可溶性蛋白，為結核病血清學診斷試劑盒開發及亞單位疫苗研究奠定基礎。威尼德系列儀器的精準控制與某試劑穩定性能的結合，顯著提升實驗重現性，具備規模化轉化潛力。
參考文獻
1. Britton WJ,Feng CG,Smith GL.Induction of CD8+ T-lymphocyte responses to a secreted antigen of Mycobacterium tuberculosis by an attenuated vaccinia virus.[J].Immunology & Cell Biology.2001,79(6).
2. A T, Kamath,C G, Feng,M, Macdonald,等.Differential protective efficacy of DNA vaccines expressing secreted proteins of Mycobacterium tuberculosis.[J].Infection and immunity.1999,67(4).1702-7.
3. P. W. ROCHE,C. G. FENG,W. J. BRITTON.Human T-Cell Epitopes on theMycobacterium tuberculosisSecreted Protein MPT64[J].Scandinavian Journal of Immunology.1996,43(6).662-670.
4. Flne, P E M.Variation in protection by BCG: Implications of and for...[J].Lancet.1995,346(8986).1339.
5. H, Li,J C, Ulstrup,T O, Jonassen,等.Evidence for absence of the MPB64 gene in some substrains of Mycobacterium bovis BCG.[J].Infection & Immunity.1993.611730-4.
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