高靈敏度化學發光技術應用心得

瀏覽次數：10462　發布日期：2010-1-4　來源：Bio-Rad

高靈敏度化學發光技術應用心得

黃磊

一．概述

化學發光 (ChemiLuminescence ，簡稱為 CL) 分析法是分子發光光譜分析法中的一類，它主要是依據化學檢測體系中待測物濃度與體系的化學發光強度在一定條件下呈線性定量關系的原理，利用儀器對體系化學發光強度的檢測，而確定待測物含量的一種痕量分析方法。化學發光與其它發光分析的本質區別是體系產生發光 ( 光輻射 ) 所吸收的能量來源不同。體系產生化學發光，必須具有一個產生可檢信號的光輻射反應和一個可一次提供導致發光現象足夠能量的單獨反應步驟的化學反應。

化學發光Western 雜交檢測，是同位素檢測的一種高度靈敏的替代方法。酶標記抗體取代了放射性標記抗體，當它作用于底物時，可產生光信號。多數特異抗原檢測方法以辣根過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(AP)二級抗體耦聯物為基礎。信號可通過感光膠片或專用的成像設備來采集。化學發光底物用于免疫印跡技術已有十幾年的歷史，目前大部分實驗室做轉印時都會采用化學發光技術進行檢測。隨著冷CCD化學發光檢測技術的發展，現在越來越多的實驗室都開始采用冷CCD的凝膠成像系統進行化學發光的檢測，膠片成像雖然比自然發光法靈敏度更高，但也有很多缺點：耗時，需要暗房，顯影劑和膠片，膠片較貴且為需持續購買的消耗品。同時由于膠片的線性范圍較窄，因此用膠片上的條帶（特別是表達量較低的條帶）進行定量幾乎不可能。冷CCD技術與X膠片相比具有瞬時影像處理、高靈敏度和高分辨率、動力范圍廣等優點，因此能對條帶進行精確定量。當然這項技術要求底物能產生高強度長持續時間的信號，以保證信號能被冷CCD的凝膠成像系統捕獲。在這方面多家公司都提供了相應的化學發光底物或試劑盒，特別是Bio-Rad公司提供的Western-C化學發光檢測試劑盒，底物可產生高強度的持續光信號24小時，因此用戶可以進行多次曝光，最低可檢測至10^-19mol，配合Bio-Rad屢獲大獎的化學發光成像系統ChemiDoc XRS或VersaDoc系統能得到得到高質量的印記信號。

我們實驗室從05年開始采用Bio-Rad的ChemiDocXRS進行化學發光的檢測，目前已經形成一套較為成熟的技術路線，取得大批的實驗數據。本文將就Western Blotting的關鍵步驟及使用ChemiDocXRS的一些心得體會與大家一起分享。

二．轉印過程

轉印蛋白的方法有多種，最常用的是電泳轉印方法，該技術具有快速、有效、并保持蛋白在凝膠中高分辨率的特性。電泳轉印技術是指在凝膠中分離的蛋白質向印跡膜載體轉印的過程。由于該技術可以準確、快速、高效的將蛋白轉印到膜上，并可以保持蛋白在凝膠中高的分辨率，而被廣泛的應用于轉移印跡技術中。

常用的電泳轉印系統有槽轉印系統和半干轉印系統，前者是將凝膠和印跡膜浸入轉印緩沖液槽，然后加電壓進行轉印；后者是將凝膠和印跡膜放置于濾紙間形成三明治結構，而后在電極平板間進行轉印。兩種系統間的比較見表1.1

表1.1 電泳轉印系統的比較

	槽轉印	半干轉印
靈活性	可靈活選擇電壓設置、轉印時間和冷卻方法；可靈活更換電極位置（Trans-Blot和Trans-Blot Plus 印跡槽）	快速、高強度轉印，使用少量電轉印緩沖液，無冷卻系統
定量和定性結果	小分子量范圍可以提供高效而定量的蛋白轉印	小分子量蛋白與印跡膜很少結合，發生轉印并穿透印跡膜
分子量范圍	寬分子量范圍	對于分子量大于120kD蛋白的轉印效率不穩定，小分子量蛋白會轉印穿透印跡膜
轉印時間	可以在不耗盡緩沖液時延長轉印時間到24h；高強度轉印只需15-60min	快速轉印；不適用于延時轉印
溫度控制	冷卻芯和循環冷卻水，可以在很低的溫度進行轉印（4-10℃），例如原酶轉印	無冷卻系統
緩沖能力	緩沖液10-12L（Trans-Blot槽）或450ml（Mini Trans-Blot槽）緩沖液不限制轉印時間	少量，每次實驗只需要250ml，節約試劑成本和縮短轉印時間

電泳轉印過程中，凝膠和印跡膜平行放置于兩極間，見圖1.2。根據歐姆定律（Ohm’s）：

V=I*R，R為兩極間物質的電阻值，（即轉印緩沖液、凝膠、印跡膜、濾紙的電阻值），當電極兩端加有電壓時，就會在上述物質間產生電流，蛋白樣品便發生轉印。

由于兩極間的電場強度（V/cm）是蛋白轉移的驅動力，因此兩極間的電壓和距離稱為凝膠上蛋白轉印的關鍵參數。同樣其他參數包括蛋白的大小、形狀、所帶電荷多少，電轉印緩沖液的pH值、黏度、離子強度、以及凝膠密度也影響著蛋白的電轉印效率。

在轉印過程中將產生大量熱量，因此對電場強度要有一定的限制。轉印中產生的焦耳熱（Joule）與電源參數P成正比，P=I*V=I²R。電泳轉印緩沖液的溫度隨著焦耳熱的增加而升高，此時其電阻卻明顯下降。電阻的降低將會使轉印過程和電場強度發生變化，從而影響電轉印緩沖液的緩沖能力。同時，系統過熱還會引起凝膠的損壞或與印跡膜發生粘連。從而槽體的散熱能力將直接影響電泳轉印效率。

本室主要以濕轉進行轉印，因此本文就濕轉為例，對化學發光和ChemiDoc XRS的應用進行敘述。
一、轉膜（濕轉）：
（1）轉一張膜需準備2張6.5*10cm的濾紙和1張5.5*8.5cm的PVDF膜。切濾紙和膜時一定要戴手套，因為手上的蛋白會污染膜。將切好的PVDF膜浸于甲醇中不少于15分鐘才可使用。
（2）在加有轉移液的搪瓷盤里放入轉膜用的夾子、兩塊海綿墊、兩張濾紙和浸過的PVDF膜。
（3）打開夾子將黑的一面放入轉膜液中，從下往上依次放入海綿、濾紙、分離膠、PVDF膜、濾紙、海綿。
     注意:1整個過程在轉膜液中進行在鋪每一層時要用刮子趕氣泡，尤其是膠與膜之間一定不能留有氣泡。
          2撬玻璃板剝膠時動作要輕，用刮子將濃縮膠輕輕刮去小心剝下分離膠蓋于濾紙上，用手調整使其與濾紙對齊
（4）將夾子合好，放到轉移槽槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。接通電電轉移時會產熱，在槽的一邊有較大空隙，放入事先準備好的冰盒來降溫。將整個電泳槽放入一個大的容器中（大的塑料泡沫盒子最好），在這個容器中盛滿冰。
（5） 250毫安恒流轉膜2小時。
（6）2小時后，將膜取出，用TBST洗膜5分鐘。
（7）用5%脫脂奶粉室溫封閉。
封閉是為了使抗體僅僅只能跟特異的蛋白質結合而不是和膜結合。
脫脂奶粉要用TBST配置，要在干凈的容器里進行封閉，且足以覆蓋住膜。
二、孵育一抗
     一抗用BSA溶解，根據抗體說明書上的要求稀釋抗體（大部分稀釋度為1：1000），4℃過夜。也可根據抗體量和膜上抗原量適當延長或縮短時間。
（有些一抗室溫孵育一小時也可得到滿意的結果）
三、孵育二抗
室溫孵育1小時。一般采用HRP標記的二抗，稀釋比例為1:2000。
二抗的稀釋比例不能太低，否則容易導致非特異性的結合。
注意：孵育二抗之前一定要用 TBST將膜洗三次，每次五分鐘，時間一定要夠。
洗滌是為了洗去二抗的非特異性結合，洗滌的效果直接影響結果背景的深淺，所以洗滌一定要干凈。
四、曝光
      本實驗室選用威格拉斯 “western 發光檢測試劑盒”，如采用Bio-Rad公司的Immun-Star WesternC化學發光試劑盒（已針對CCD成像做了優化），可獲得更好的效果。
（1）洗膜，2至3次，每次5分鐘
（2）在照膠儀放膜的平板上加少許水，取一張與平板大小合適的保鮮膜鋪在平板上，排氣泡。
作用：a 保證PVDF膜能在一個相對干凈的平臺上曝光，避免污染。
        b 鋪上保鮮膜后，背景顏色是純黑色且深淺均勻，這樣當半透明的PVDF膜在白測光下照Marker時，會更清晰、明顯。
（3）將膜放入照膠儀，調整明暗、大小、焦距，在目的條帶的marker出，用圓珠筆標一個印記。
（4）選擇EPI WHITE 光，點擊“White Epi IIIumination”點擊 Auto Expose 獲取marker圖片，圖片最大化，選中圖片，選擇file ->export to jpeg，quantity調至最大值100，保存至文件夾。保存為jpeg格式后，轉至其他電腦即使未安裝quantity one 軟件也可用其他圖像軟件編輯圖片。
（5）將發光液A液和B液按1：1比例混勻、倒在PVDF膜上，發光液能蓋住膜即可，關閉WHITE EPI光（注意膜的位置從照Marker開始，不要改變）點擊“Chem Hi Sensitivity”，點擊“Live Acquire”選擇合適的曝光時間，張數，選擇指定文件夾，保存。
選擇比較滿意的圖片，按如上所說轉換至jpeg格式。
例如，Caveolin-3、AKT、ERK、GSK等比較好曝的，可以調至10s一張，一般10張之內就可得到好的效果。其他不太容易出條帶的，可以適當延長時間。
        對于內參來說，在曝第一張之前，讓發光液倒在膜上靜置反映20-30秒，有時會得到理想的效果。
（6）marker與目的條帶的比對：用 window自帶的“圖片和傳真查看器”軟件打開jpeg格式的marker圖片，用手在屏幕上點住剛剛用圓珠筆畫的印記，手不要松開，此時還用“圖片和傳真查看器”打開jpeg格式的目的條帶的圖片，手點的地方就是剛才marker的位置。

白測光下獲取的marker圖像

化學發光下目的蛋白條帶    蛋白上樣量：120μg 分離膠濃度：12%

白測光下獲取的marker圖像

化學發光下目的蛋白條帶蛋白上樣量：80μg 分離膠濃度：12%

白測光下獲取的marker圖像

化學發光下目的蛋白條帶蛋白上樣量：50μg 分離膠濃度：15%

結論：采用Bio-Rad的冷CCD化學發光成像系統進行化學發光的檢測，比傳統的暗室曝光方法更為簡便，也大大縮短了實驗時間。但在成像時需要注意選擇合適的化學發光試劑，以適合CCD的成像檢測。且大部分的化學發光試劑均對應暗室曝光的方式，因此在進行檢測需要進行調整，如對發光液不能進行稀釋，而必須要使用原液。同時如果條帶的表達比較弱的情況下，如使用常用發光液可能需要更長的成像時間，當然更好的方法是選擇能快速產生強烈信號的化學發光試劑，如Bio-Rad公司的Immun-Star WesternC化學發光試劑盒。