——western blot技術在蛋白定量分析中的選擇應用

蛋白質印跡(western blot)，它是根據抗原抗體的特異性結合檢測復雜樣品中的某種蛋白的方法。western blot 是在凝膠電泳和固相免疫測定技術基礎上發展起來的一種新的免疫生化技術。由于免疫印跡(western blot)具有SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，現已成為蛋白分析的一種常規技術。免疫印跡(western blot)常用于鑒定某種蛋白，并能對蛋白進行定性和半定量分析。

如何選擇蛋白印跡成像與定量分析技術？通常，Western Blot顯色的方法主要有以下幾種：1、放射自顯影；2、底物化學發光ECL；3、底物熒光ECF；4、底物DAB呈色等。下面我們將分別對這四種方法進行介紹，同時向大家呈現每種方法的應用特點。

放射自顯影radioautography：利用放射性核素發射的射線，使感光材料中的鹵化銀等感光，顯出影像后進行放射性標記物的定位和定量測量的技術。此技術的特點是靈敏度高、分辨率好、保存時間長久，但由于實驗所用方式性物質對人體有輻射作用，目前該技術在蛋白研究中應用較少，多用于研究標記化合物在機體、組織和細胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機理、作用部位等等。

底物DAB呈色：二氨基聯苯胺（Diaminobenzidine,DAB）是辣根過氧化物酶最敏感、最常用的顯色底物，反應產物因不溶于水、二甲苯和醇的棕色沉淀物而被廣泛地用于蛋白印跡（Western Blot,WB)、免疫組織化學(Immunohistochemistry,IHC)和免疫細胞化學(Immunocytochemistry,ICC)、斑點印跡(Dot blot)和生物芯片(Biochip)等的染色和顯色反應。用之進行對底物顯色即被稱為底物DAB呈色法。此技術成本低，操作也較簡單是常用的western blot成像分析技術之一，不過由于其靈敏度稍低，在目的蛋白表達量較少的情況下可能沒有理想的結果應慎用。

底物化學發光ECL：化學發光是在一些特殊的化學反應中吸收了反應釋放的化學能,而處于電子激發態的反應中間體或反應產物由激發態回到基態時所產生的一種光輻射,化學發光分析是根據化學反應產物的光輻射(化學發光)確定物質含量的一種痕量分析方法。它的特點是靈敏度高和線性范圍寬，不需要任何光源。

傳統的化學發光檢測方法通常需要膠片成像，膠片成像可以保證較高的靈敏度，但也有很多缺點：耗時，需要暗房和顯影劑，膠片很貴，而且需要很多消耗品，需要持續購買。另外，用膠片上的蛋白條帶進行定量也是幾乎不可能，和目測一塊考馬斯藍染的膠沒什么區別，而且膠片成像時間只能預先設定，如果曝光過度或者不足則需要再次進行實驗，非常麻煩。

數字成像系統的出現極大克服了傳統膠片法的一些弊端，近年來隨著冷卻CCD技術的發展，數字成像系統成本越來越低，成像效果同時獲得大大提升，因而CCD成像系統逐漸成為了實驗室Western Blot的主要設備。同時目前很多Western blot的新技術也都是針對CCD成像系統的，目前CCD成像系統的靈敏度已經可以達到甚至超過傳統的膠片成像。冷卻型CCD照相機與X膠片相比具有瞬時影像處理、高靈敏度、高分辨率、動力學范圍廣等優點，而且還不需要膠片處理裝置、后續耗材投入及暗室。

底物熒光ECF：是利用的熒光染料（如Cy2 ,Cy3, Cy5）標記二抗，標記熒光染料的二

抗分別對應相應的目的蛋白，以此實現通過檢測熒光染料的信號強度，實現種蛋白信號的檢測，以進行精確的定量分析。熒光檢測Western Blot本來不是檢測的主流方法，不過熒光法檢測允許在同一張轉印膜上用不同顏色的熒光底物同時檢測不同的目標。

在做western blot的檢測時，有時會碰到電泳后兩個分子量相近的蛋白分離不開，距離相近或者重疊，例如磷酸化和非磷酸化的蛋白；或者是同一次實驗中，檢測一種以上的蛋白抑或是利用內參蛋白對目的蛋白的定量分析進行標準化。遇到以上這樣的實驗需求，化學發光的檢測方法會顯得繁瑣復雜，其必須經過剝脫抗體和重行孵育新抗體的過程，不僅耗時費力，而且不能進行精確的定量分析，由此多色熒光成像的技術應運而生。多色熒光成像，是利用不同的熒光染料（如Cy2 ,Cy3, Cy5）標記二抗，標記不同熒光染繞的二抗分別對應不同的目的蛋白，以此實現通過檢測不同熒光染料的信號強度，間接實現一次實驗可檢測多種蛋白，同時也可以進行精確的定量分析。

根據這一應用需求，美國著名的成像技術公司Alpha Innotech公司推出的Fluorchem Q 成像系統，是凝膠成像專家Alpha Innotech公司秉承其銳意創新的精神，憑借其近20年來豐富的成像經驗而推出的集化學發光成像，多色熒光成像，可見光成像多種功能于一體的高端成像系統。 其420萬像素，0.95 大光圈鏡頭保證了其靈敏的化學發光成像，雙反射高強度三色LED燈及透射紫外光源可實現多達5種熒光染料的檢測， 以及其特制的低背景樣品架都保證了其出眾的多色熒光成像性能。Fluorchem Q除了擁有出色的硬件配置，其簡便、快捷、流水線設計的Alphaview Q軟件更是無人出其右, Alphaview Q軟件具有多通道熒光成像程序，即可自動切換激發光源和濾光片，完成多通道熒光圖像的的拍攝。獨特的channel view功能，可以單獨觀察每個熒光通道的圖像；流水線式的定量分析多色熒光條帶或斑點。

總之，經典的western blot技術結合不斷進步的科學技術，使蛋白定量分析更靈敏、操作更加簡便。同時，western blot技術儀器也更加專一、高效，這就要求我們在開展western blot實驗時，需要就如何選擇蛋白印跡成像與定量分析技術進行選擇確定，以保證選擇工具的適用性。