【摘要】 目的 通過針刺的方法治療阿爾茨海默病模型大鼠,觀察對其學習和記憶的改善效果。方法 通過給大鼠灌服 D-半乳糖制劑,造成大鼠阿爾茨海默病模型。分別設立正常組、模型組、藥物組、針刺組、電針組。正常組、模型組只給予相同劑量的生理鹽水灌服,藥物組給予石杉堿甲片(哈伯因)混懸液灌服治療,針刺組采用針刺百會、神庭、腎俞、太溪、足三里的方法進行治療,電針組采用針刺百會、神庭、腎俞、太溪、足三里穴,并連接電針儀進行治療。以 10 d 為 1 個療程,共治療3 個療程。通過大鼠跳臺試驗來檢測大鼠的學習和記憶能力,并對大鼠大腦海馬 CA1 區的 tau 蛋白含量進行觀察。 結果 造模后,正常組大鼠的記憶逃避潛伏期時間明顯少于模型組(P＜0.05),治療結束后藥物組、針刺組、電針組的逃避潛伏時間短于模型組(P＜0.05)。電針組的療效優于針刺組和藥物組(P＜0.05)。而治療后,海馬 CA1 區的 P-tau 蛋白表達治療組都低于模型組,且電針組的效果要優于藥物組和針刺組(P＜0.05)。結論 運用電針能改善阿爾茨海默病模型大鼠的記憶能力,對阿爾茨海默病有一定的治療作用。 
【關鍵詞】 針刺;阿爾茨海默病;記憶能力;大鼠 
 
隨著年齡的增大,老年人中癡呆的發生率逐漸增高,其中以阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)最為多見。這是一種中樞神經系統(大腦)神經細胞的脫髓鞘式退變。臨床上主要表現為記憶能力、判斷能力、學習能力以及行動能力、生活自理能力普遍下降,給患者生活質量和家庭生活都帶來了不利的影響。目前尚未有特效藥物和治療方法問世,中醫的針灸治療在臨床上卻收到了較為明顯的改善效果。其中的作用機制卻未被揭示,本文從神經行為學和組織化學的層面作了觀察,期望為針刺治療該病的機制提供佐證。 1 材料與方法 
1.1 材料 
1.1.1 主要器材 
采用由上海欣軟信息科技有限公司生產的Morris 水迷宮,為改良型水迷宮,其跳臺可以定時出現。由日本株式會社生產的 B50 型天平,由美國 Sigma生物技術有限公司提供的測試AD P-tau蛋白的原位雜交試劑盒。中國江蘇華佗醫療設備廠出產的“長城牌”電針儀。 
1.1.2 主要應用試劑 
誘發 AD 模型所用 D-半乳糖由北京貝瑞和康生物技術有限公司生產,藥物組所用藥物為河南竹林眾生制藥有限公司生產的石杉堿甲片(哈伯因)混懸液。 
1.2 動物篩選 
將所有購自黑龍江中醫藥大學動物實驗中心的Wistar 大鼠放入水迷宮中,進行適應性的游泳訓練,記錄其游泳距離,學習逃避潛伏期和學習錯誤次數,訓練 1 星期。然后將游泳能力障礙、學習記憶能力先天不足的大鼠予以淘汰,最后選取符合實驗條件的 50 只大鼠進入最后實驗程序。 
1.3 模型制備方法 
將準備造模的大鼠放入相同環境中進行適應性喂養 1 星期,保持充足的光線、水分和食物。然后按每只大鼠每千克體重 200 mg 的劑量向臍腹部注射 D-半乳糖,每日注射 1 次。一共持續 6 星期時間。然后將所有造模大鼠編號,按隨機原則分為模型組 10 只、藥物組10 只、針刺組 10 只、電針組 10 只。取正常大鼠 10只作為正常組。 
1.4 治療方法 
治療開始后,正常組、模型組均給予每日捆綁30 min,并灌服與藥物組灌服藥物相同量的生理鹽水;藥物組則每日灌服石杉堿甲片混懸液 2 mL(17 mg);針刺組則用華佗牌0.30×13 mm針灸針針刺大鼠百會、神庭、腎俞、太溪、后三里穴,得氣后行針 2 min,留針 30 min;電針組則在針刺組的基礎上接“長城牌”電針儀,采用疏密波,時間 30 min。百會穴在頭頂正中線中點頭骨中央;神庭穴在頭頂正中線前端;腎俞穴在后正中線上,于第二腰椎棘突下旁開 1 寸;太溪穴在后肢踝部外側后方凹陷處;后三里在大鼠后肢膝部外側前下方。 所有大鼠治療時間為 6 星期,每日治療 1 次。 
1.5 測試和取材觀察方法 
跳臺試驗。Morris 水迷宮的游泳池中有一塊橡膠平臺,離水面有 1 cm。將大鼠放入水池中開始記時,當大鼠通過游泳尋找到水下的平臺時記為學習逃避潛伏期。24 h 后再重復以上試驗,第 2 次所需時間為記憶逃避潛伏期。以此作為大鼠的學習和記憶能力的反應指標。分別在造模前第 1 星期、治療前第 7 星期、治療后第13星期3個時間點進行大鼠學習逃避潛伏期和記憶逃避潛伏期的測試。 
水迷宮試驗結束后,將大鼠進行麻醉,接著通過腦過量灌注致其死亡。將大鼠頭骨切開取出大鼠腦組織,放入深度為 4%的 1/1000 DEPC 溶液中保存,再使用多聚甲醛予以固定待檢。將固定的腦組織由額極向枕極順序平均分成 5 份,取出第 2 份腦組織放入 24℃的水中用乙醇進行梯度脫水處理。其順序是 70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇 1 度、100%乙醇 2 度、100%乙醇 3 度,然后染色切片并用二甲苯使組織透明。用AD P-tau 蛋白原位雜交試劑盒進行 tau 蛋白過度磷酸化陽性檢測。細胞中出現的棕黃色顆粒者即為過度磷酸化 tau 蛋白表達。最后對 tau 蛋白陽性表達數進行統計。 
1.6 統計學方法 
用電子計算機編輯圖像和表格。所有數據用SPSS13.0 軟件包進行統計。計量資料的表示方式為均數±標準差,用方差來分析組與組之間的均數對比,以P ＜0.05 為衡量標準。在對陽性細胞數的觀察時每個載玻片取 3 個視野,計取其平均顆粒數。 
 2.1 大鼠的一般情況 
正常組的大鼠體力充沛,反應靈敏,動作迅捷,毛色光澤,飲食、排便情況正常。 造模組大鼠均出現不同程度的神疲乏力,反應遲笨,行動萎鈍,體力差,毛色粗糙,飲食量差,排便少或便質稀溏。這種情況自造模后開始呈現,直至實驗結束。 
2.2 大鼠行為學指標觀察結果 
從表 1 可以看出,造模前各組大鼠的學習逃避潛伏時間大致相等,差異無統計學意義(P ＞0.05);治療前(即造模 6 個月后),各造模組大鼠學習逃避潛伏時間明顯延長,與正常組相比差異有統計學意義(P ＜0.05),提示造模成功,大鼠學習能力有所下降,具備AD 初步特征。治療后,即第 13 星期,各治療組大鼠的學習逃避潛伏時間又比模型組明顯縮短,差異有統計學意義(P ＜0.05),說明經過針刺或藥物治療,AD 大鼠學習能力有了一定的恢復。而電針組的情況更為樂觀,與其他治療組相比,學習逃避潛伏時間縮短更為明顯,差異有統計學意義(P ＜0.05)。從表 2 可以看出,造模前各組大鼠的記憶逃避潛伏時間大致相等,差異無統計學意義(P ＞0.05);治療前(即造模 6 個月后),各造模組大鼠記憶逃避潛伏時間明顯延長,與正常組相比差異有統計學意義(P ＜0.05),提示造模成功,大鼠記憶能力有所下降,具備AD 初步特征。治療后,即第 13 星期,各治療組大鼠的
記憶逃避潛伏時間又比模型組明顯縮短,差異有統計學意義(P ＜0.05),說明經過針刺或藥物治療,AD 大鼠記憶能力有了一定的恢復。而電針組的情況更為樂觀,與其他治療組相比,記憶逃避潛伏時間縮短更為明顯,差異有統計學意義(P ＜0.05)。 
3 討論 
許多研究都充分地證實,人對空間結構的學習能力和記憶能力更多地建立在大腦組織中的海馬神經元,而 AD 則是對該區的腦組織造成持續性的神經細胞的退行性改變而使空間學習和記憶能力下。學習和記憶能力作為癡呆患者智力指標的重要考查要點,具有金指標的指示地位,所以在實驗中我們把大鼠的學習、記憶逃避潛伏期作為觀察指標
。以上的結果清楚地表明,經過腹腔灌服 D-半乳糖后,AD 模型大鼠的空間學習和記憶能力已經是明顯退化了,說明 D-半乳糖的吸收可以造成大鼠大腦細胞退行性改變,tau
蛋白等負面物質的產生,使大腦功能退化。然而通過針刺后,大鼠在水迷宮的表現令人欣慰,雖然在治療的 6星期期間,大鼠的腦細胞仍然處于退變狀態,但潛伏時間并沒有下降得很快,甚至電針組還有所提升,實驗證實,針刺治療能夠與西藥一樣起到改善腦部功能的作用。經過治療,大鼠的學習和記憶能力都較治療前有回升。當然,由于 AD 不僅是功能變化,也有一部分器質上的改變,所以針刺只能在一定范圍內起到治療恢復的作用,而不能使 AD 大鼠的記憶功能完全恢復,但是實驗也顯示,電針相對于普通針刺更有效,說明如果對針刺手法和方式進行改進,能夠進一步擴大療效,使治療后效果無限接近于正常。從生物化學層面分析,tau 蛋白過量產生,對腦功能是一種負面影響,藥物組和針刺
組都不同程度地達到抑制該蛋白產生的目的。而電針能更有效地降低 tau 蛋白的表達率,一方面說明了 tau的確對大鼠記憶系統造成紊亂,另一方面也提示如果能降低 tau 蛋白的表達,那么就能一定程度地改善大腦功能。